Инактивация бактерий с помощью активируемого светом флавинмононуклеотида

Начните с инокуляции патогенной бактерии в пробирку, содержащую жидкую среду.

Инкубируйте, чтобы способствовать размножению бактерий, затем переложите культуру в свежие пробирки.

Раскрутите ячейки в гранулы и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте бактериальные гранулы в буферных растворах, содержащих возрастающие концентрации флавинмононуклеотида (ФМН), фотосенсибилизатор и буферный раствор без ФМН в качестве контроля.

Тщательно перемешайте содержимое тубы и переложите суспензию в стеклянные пробирки.

Подвергните трубки воздействию видимого света, чтобы фотоактивировать FMN, который реагирует с молекулярным кислородом с образованием активных форм кислорода (АФК).

АФК повреждает бактериальные клеточные компоненты, тем самым снижая жизнеспособность бактерий.

Перенесите образцы аликвот на твердую среду, равномерно распределите их и инкубируйте, чтобы выжить жизнеспособным бактериям удалось вырасти в колонии.

После инкубации количественно оцените колонии и рассчитайте процентное снижение жизнеспособности бактерий по сравнению с контролем для оценки дозозависимого эффекта ФМН.

Инокулируйте колонию золотистого стафилококка в 10 миллилитров лизогенного бульона в 15-миллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой. Выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов в шейкере. Переложите 0,5 миллилитра культуры в 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку.

Разбавьте культуру до оптической плотности 0,5 на 600 нанометрах путем добавления стерилизованной воды. Затем переложите 0,5 миллилитра культуры в 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку. Центрифугируйте при 14 000 G в течение 10 минут и сцедите надосадочную жидкость.

Добавьте один миллилитр буферизованного раствора ФМН в ячейку и сделайте вихрь. Для контроля облучения добавьте один миллилитр фосфатного буфера. Перелейте один миллилитр раствора бактериальной клетки, содержащего 30-микромолярный ФМН и фосфатный буфер, в стеклянные пробирки.

Поместите их для излучения под фиолетовый свет мощностью 10 Вт на квадратный метр на 30 минут. Затем переведите один миллилитр раствора бактериальной клетки, содержащего 30, 60 и 120 микромолярных ФМН и фосфатный буфер, в стеклянные пробирки. Облучайте синим светом в течение 120 минут при мощности 20 Вт на квадратный метр.

Также облучают трубку, содержащую один миллилитр 120-микромолярного ФМН, в течение 60 минут. После облучения добавьте 0,2 миллилитра реакционного раствора на пластину с агаром Лурия. Распределите раствор с помощью Г-образного стеклянного стержня и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день рассчитайте количество жизнеспособных пластин и скорость инактивации золотистого стафилококка.