Селективная очистка бактериального белка методом отрицательной ионообменной хроматографии

Начните с раствора ионообменной смолы, содержащего положительно заряженные функциональные группы для селективного связывания с белками.

Затем возьмите белковый экстракт, полученный из бактериальных клеток хозяина, сконструированных для сверхэкспрессии фактора вирулентности патогенной бактерии Helicobacter pylori.

Экстракт содержит целевой фактор вирулентности вместе с белками клетки-хозяина в буфере при pH 8.

Смешайте белковый экстракт со смолой и инкубируйте с перемешиванием, чтобы обеспечить равномерное взаимодействие белка и смолы.

Белки-хозяева, имеющие изоэлектрические точки ниже буферного pH, становятся отрицательно заряженными и связываются с положительно заряженной смолой.

Белок-мишень с изоэлектрической точкой, близкой к буферному pH, остается в значительной степени незаряженным и остается несвязанным.

Перенесите белково-смоляную суспензию в хроматографическую колонку и дайте смоле осесть.

Соберите жидкую фазу, содержащую несвязанный целевой белок.

Промойте смолу вместе с буфером, чтобы обеспечить максимальное восстановление целевого белка.

Чтобы приготовить 15 миллилитров смолы DEAE, суспензируйте 0,6 грамма сухого порошка смолы DEAE в 30 миллилитрах буфера Tris-HCl при комнатной температуре не менее чем на один день.

Центрифугируйте смолу при 10 000 умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение одной минуты, а затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 15 миллилитров буфера Tris-HCl. Повторив центрифугирование, повторите шаги ресуспензии еще четыре раза, храните 15 миллилитров осевшей смолы при температуре четыре градуса Цельсия для последующего использования.

Работая при температуре четыре градуса Цельсия, добавьте 45 миллилитров подготовленных растворимых белков в 15 миллилитров смолы и переложите в стакан объемом 100 миллилитров с перемешиванием. Перемешайте суспензию из белковой смолы с помощью мешалки при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа. Затем налейте суспензию белковой смолы в пластиковую или стеклянную колонку, оснащенную запорным краном, и дайте смоле осесть под действием силы тяжести.

Откройте запорный кран, чтобы белковый раствор мог проходить через колонну под действием силы тяжести, пока уровень жидкости в колонне не не окажется чуть выше смолы. Соберите поток в виде несвязанной фракции, которая содержит очищенный белок, активирующий нейтрофилы. Добавьте в колонку 15 миллилитров ледяного буфера Tris-HCl.

Снова откройте запорный кран, чтобы промывочный буфер мог проходить через колонну под действием силы тяжести, пока уровень жидкости в колонне не не окажется чуть выше смолы. Соберите проточный поток как фракцию промывки. Повторите стирку с ледяным буфером еще четыре раза, чтобы собрать дополнительные фракции стирки.