Синхронизация культур цианобактерий и уплотнение ДНК на основе циклов «свет-темнота»

Начните с богатой питательными веществами агаровой пластины, дополненной тиосульфатом.

Размножите цианобактерии и инкубируйте их в чередующиеся светлые и темные периоды, чтобы поддерживать циркадный цикл.

В течение светового периода поглощение питательных веществ и тиосульфат поддерживают рост бактерий и конденсацию ДНК.

В темный период клетки сохраняют энергию и делятся.

Чередующийся цикл света и темноты синхронизирует клетки с одной и той же стадией роста и деления.

После светового периода добавьте раствор сахарозы и несколько раз проведите пипетку, чтобы выпустить цианобактерии, вызывающие изменение цвета. Переложите клетки в трубку.

Добавьте специфичный для ДНК флуоресцентный краситель и инкубируйте в темноте. Краситель связывается с ДНК цианобактерий.

Центрифуга отделит цианобактерии и удалит надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте цианобактерии в растворе сахарозы, переложите суспензию на предметное стекло и накройте ее.

Под флуоресцентным микроскопом синяя конденсированная ДНК в клетках подтверждает синхронизированную, регулируемую циркадиями прогрессию клеточного цикла цианобактерий.

Начните с выращивания цианобактерий на девятисантиметровых, стерилизованных пластинах BG-11, содержащих 1,5% агара и 0,3% тиосульфата натрия. Инкубируйте планшеты при температуре 23 градуса Цельсия при 12-12 световом цикле с 50 микро-Е светом на квадратный метр в секунду. Чтобы сохранить клетки, еженедельно перекладывайте их на свежие агаровые пластины BG-11.

В течение одной недели культуры появляются в виде зеленых полос. Перенесите зеленые скопления клеток с помощью стерилизованной пламенем петли и нанесите их на новую пластину. Чтобы наблюдать за уплотнением ДНК, соберите клетки, культивируемые в течение шести дней в конце светового периода.

Чтобы освободить клетки от пластины, добавьте один миллилитр 0,2-молярной сахарозы. Затем соберите клеточную суспензию и повторяйте добавление и удаление сахарозы до тех пор, пока раствор не станет зеленым. Изменение цвета указывает на то, что большая часть клеток была высвобождена.

Теперь перенесите 500 микролитров раствора взвешенных клеток в пробирку Microfuge и добавьте краситель Hoechst для конечной концентрации один микрограмм на миллилитр. Затем дайте клеткам инкубироваться в темноте в течение 10 минут. Далее раскрутите клетки, выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте их в 10 микролитрах 0,2-молярной сахарозы.

Далее переложите один микролитр суспензии на предметное стекло, наденьте покровную крышку и понаблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом, оснащенным УФ-фильтром. Используя объектив для 100-кратного погружения в масло, ищите признаки уплотнения ДНК, которое должно наблюдаться в большинстве клеток.