Энциклопедия экспериментов JoVE
Microbiology
0 просмотров • 2:44 мин. • October 30th, 2025
Возьмите гель SDS-PAGE, содержащий белковые полосы из мембранных частиц белка-нанолипопротеина. Эти комплексы несут белок олигомерной мембраны Chlamydia или МП, перспективный вакцинный антиген против инфекции Chlamydia .
В качестве контроля используйте белковые полосы из очищенной олигомерной МП.
Соберите гель, мембрану вестерн-блоттинга и блоттинговые компоненты в сухую блоттинговую систему.
Подайте электрический ток для переноса растворенных белков на мембрану.
Снимите мембрану и инкубируйте ее в буфере, содержащем детергенты и первичные антитела.
Детергенты блокируют неспецифические сайты взаимодействия, в то время как первичные антитела нацелены на МП.
Промойте мембрану, чтобы удалить несвязанные первичные антитела.
Инкубируйте с фторконъюгированными вторичными антителами, нацеленными на первичные антитела.
Промойте мембрану, чтобы удалить излишки вторичных антител.
Получение флуоресцентных изображений мембраны.
Молекулярные полосы, соответствующие контрольной олигомерной МП, подтверждают структурную целостность МП в комплексах, поддерживая ее антигенный потенциал.
Разрешите образцы с помощью SDS-PAGE и перенесите гелевые стеки с помощью коммерческой системы сухого блоттинга для вестерн-блоттинга. Извлеките блоты из стопки и инкубируйте их в течение ночи при четырех градусах Цельсия в блокирующем буфере, содержащем 0,2% TWEEN 20 и 0,5 мкг на миллилитр MAb40, или 0,2 мкг на миллилитр антитела MAbHIS antiHIS-tag, направленного против HIS-метки из белка дельта-49ApoA1.
Промойте каждую кляксу PBST три раза в течение пяти минут за одну стирку. Инкубируйте блоттинги в течение одного часа в блокирующем буфере, содержащем вторичное антитело, конъюгированное с флуорофором в разведении от 1 до 10 000. Повторите смывки с помощью PBST и сделайте снимок с помощью флуоресцентного тепловизора после окончательной промывки.