Выделение эндоспор из образца окружающей среды путём целевого лизиса вегетативных клеток

Возьмите образец окружающей среды, содержащий вегетативные клетки и эндоспоры бактерии, образующей эндоспоры, а также другие бактерии.

Эндоспоры имеют защитную оболочку, которая помогает им выживать в неблагоприятных условиях.

С помощью вакуумного фильтрационного блока фильтруйте образец, чтобы задержать клетки и эндоспоры на мембране.

Положите мембрану в форму и нарежьте её на мелкие кусочки.

Переместите детали в трубку, добавьте буфер и перемешайте трубку, чтобы освободить клетки и эндоспоры.

Инкубировать с помощью возбуждения при высокой температуре, чтобы ослабить вегетативные клеточные структуры, не повреждая эндоспоры.

Остудите образец, затем добавьте лизоцим и инкубируете с помощью перемешивания. Лизоцим нарушает клеточную стенку вегетативных клеток, вызывая их разрыв.

Добавьте гидроксид натрия и моющее средство и инкубируете, чтобы разложить клеточные макромолекулы и остатки, сохраняя при этом устойчивые эндоспоры.

Отфильтруйте образец, чтобы выделить эндоспоры. Промыйте эндоспоры, чтобы удалить избыточные реагенты и подготовить их к дальнейшему анализу.

После того как фильтрационный блок и вакуумный насос будут подготовлены согласно текстовому протоколу, используйте стерильные щипцы с этанолом, чтобы добавить стерильную нитроцеллюлозную мембрану в фильтрационный блок. Добавьте половину только что подготовленного супернатантного образца на мембранную фильтрационную установку и используйте вакуумный насос для сбора клеток на мембране. Когда жидкость полностью пройдёт через фильтр, остановите вакуумный насос.

Используйте стерилизованные щипцы, чтобы аккуратно удалить мембрану и поместить её в стерильную чашку Петри. С помощью свежего кусочка стерильной мембраны повторите фильтрацию с оставшейся половиной раствора. Чтобы отделить эндоспоры от вегетативных клеток в только что собранной биомасе, мембрану разморозить, если она была заморожена, и использовать стерильные ножницы, обработанные этанолом, чтобы разрезать её на мелкие части.

Переложите мембранные части в стерильную двухмиллилитровую трубку и добавьте 900 микролитров буфера 1X TE. Тщательно перемешайте с помощью вихря, чтобы освободить биомассу из мембраны. Инкубировать трубку при 65 градусах Цельсия и 80 оборотах в минуту в течение 10 минут.

Затем выньте трубку из инкубатора и дайте ей остыть 15 минут. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленного лизозима до конечной концентрации два миллиграмма на миллилитр и инкубуйте образец при 37 градусах Цельсия и 80 об/мин в течение 60 минут, чтобы лизировать вегетативные клетки. После завершения лизиса добавьте в образец 250 микролитров 3 обычных гидроксида натрия и 250 микролитров 6% раствора SDS. Инкубировать при комнатной температуре и 80 об/мин в течение 60 минут.

Далее подготовьте стерильную фильтрационную установку, которая удерживает мембраны диаметром 25 миллиметров с помощью автоклава. После охлаждения фильтрационного блока наложите на него мембрану нитроцеллюлозы диаметром 25 миллиметров диаметром 0,2 микрометра.

Добавьте образец на мембрану и используйте вакуумный насос для фильтрации жидкости, захватывая эндоспоры на мембране, пока вегетативный материал клетки проходит через неё.