Мягкий агаровый наложенный анализ для обнаружения бактериоцино-опосредованного уничтожения у сирингов Pseudomonas

Начните с расплавленного мягкого агара, поддерживаемого при тёплой температуре.

Инокулировать культуру Pseudomonas syringae , тестовый штамм, в агар.

Затем кратковременно используйте вихрь, чтобы равномерно распределить клетки.

Вылейте смесь на затвердевшую агарную тарелку и равномерно распределите.

Закройте крышку и дайте ей затвердеть.

Зафиксируйте фильтрованный супернатант на поверхности затвердевшего агара.

Супернатант содержит бактериоцин — антибактериальную молекулу, полученную из стресс-индуцированного донорского штамма P. syringae .

Инкубировать пластину, чтобы обеспечить рост бактериоцинов и диффузию бактериоцина через агар.

Бактериоцин связывается с определёнными поверхностными рецепторами тестового штамма и нарушает его мембрану, что приводит к гибели клеток.

Это приводит к образованию прозрачной зоны на агаре, указывающей на область, где тестовый штамм был уничтожен антибактериальной молекулой бактериоцином.

Разбавьте культуру от 1 до 100 до свежей КБ. Инкубировать культуру в течение трёх-четырёх часов, встряхивая при комнатной температуре. Далее подготовьте стерилизованный водный агар, автоклавируя суспензию агара в сверхчистой воде.

Храните расплавленный мягкий агар в водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия перед использованием. Используя стерильную серологическую пипетку, перенесите три миллилитра мягкого агара в стерильную культурную трубку. Верните культивационную трубку в водяную баню, чтобы поддерживать её в расплавленном состоянии.

Перед заливкой накладки дайте расплавленному агару остыть, но не дайте ему затвердеть.

Крайне важно, чтобы агар оставался в горячем, полностью расплавленном состоянии перед прививкой. Если нет, наложение будет выглядеть зернистым и будет сложнее интерпретировать.

В стерильном капюшоне инокулируйте 100 микролитров культуры тестера в мягкий агар и вихрь для смешивания. Поворачите культуру вручную 10–15 секунд, затем вылейте на дно тарелки для агара. Наклоните пластину во все стороны, чтобы мягкий агар равномерно покрывал нижний агар.

Накройте тарелку и дайте ей затвердеть 20–30 минут. Будьте осторожны, чтобы не потревожить пластину во время затвердевания. После затвердевания нанесите на накладку от двух до пяти микролитров супернатанта.

Дайте тарелкам инкубировать ночь при комнатной температуре. Наблюдайте и фиксируйте результаты на следующее утро. С помощью этого метода два штамма P. syringae ингибируются разными бактериоцинами. Штамм A чувствителен к бактериоцину с высокой молекулярной массой — тайлоцину, но не чувствителен к альтернативному бактериоцину с низкой молекулярной массой.