Трансфекция индуцируемой системы экспрессии генов в клетки, экспрессирующие бактериальный эффекторный белок

Проведите тест на человеческие клетки, экспрессирующие CaeB — антиапоптотический бактериальный белок.

Используйте клетки без CaeB в качестве контроля.

Введите трансфекционный реагент, комплексный с системой экспрессии генов, индуцируемой тетрациклином, содержащей как регулятор, так и реакционный плазмиды.

Регуляторная плазмида кодирует транскрипционный активатор и глушитель, а ответная плазмида кодирует проапоптотический белок, контролируемый TRE.

Инкубировать клетки для облегчения поглощения плазмид и регуляционной экспрессии белков.

Без тетрациклина активатор остаётся неактивным, а глушитель подавляет транскрипцию, управляемую TRE.

Добавьте аналог тетрациклина и инкубируете.

Аналог обеспечивает связывание активатором и TRE, инициируя экспрессию проапоптотического белка.

В контрольных клетках это запускает апоптотическую сигнализацию, активируя апоптотический маркер.

В клетках, экспрессирующих CaeB, CaeB подавляет апоптотическую сигнализацию, снижая активацию маркера.

Сниженная активация маркера в клетках, экспрессирующих CaeB, указывает на подавление апоптоза CaeB.

Начните эту процедуру с посева клеток HEK293, стабильно экспрессирующих GFP или GFP-CaeB в пластине на 12 лунок с плотностью 100 000 клеток на колодцу.

Далее подготовьте отдельно реагент для трансфекции ДНК и полиэтиленимина в 75 микролитрах среды Opti-MEM и инкубировать пять минут при комнатной температуре. Для сложного образования инкубировать обе смеси вместе в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого добавляйте раствор полиэтиленимина по капле в клетки и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в 5% углекислого газа.

Через пять часов после трансфекции индуцируют экспрессию проапоптотических белков, добавляя один микрограмм на миллилитр доксициклина в культурную среду. Затем инкубировать клетки в течение 18 часов при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.