Подход, основанный на жидкой хроматографии и масс-спектрометрии, для анализа метаболитов из S. aureus

Начнём с Staphylococcus aureus , взвешенного в растворе с кремнеземными шариками, хранящегося при низкой температуре для сохранения метаболического состояния.

Гомогенизация бактерий в холодных условиях для высвобождения внутриклеточного содержимого при минимизации ферментативного разложения метаболитов.

Центрифугуйте лизат и собирайте насыщенный метаболитами супернатант.

Добавьте органический растворитель в экстракт и создайте вихрь, чтобы осакоть макромолекулы растворимых метаболитов.

Центрифуга, чтобы пеллетировать осадок и пересадить супернатант в флаконы.

Загрузите флаконы в систему жидкой хроматографии и масс-спектрометрии.

Внутри хроматографической колонки метаболиты взаимодействуют с твердой стационарной фазой в зависимости от своих химических свойств.

Добавьте буфер для элюирования метаболитов. Затем направьте метаболиты в источник ионизации масс-спектрометра с помощью электроспрея, чтобы ионизировать их.

Затем ионы разделяются на основе их соотношения массы к заряду.

Полученные данные сравниваются с эталонной базой данных для идентификации метаболитов.

Для начала извлечения метаболита образцы сначала оттаивают на влажном льду. Затем нарушайте работу ячеек в гомогенизаторе с помощью четырёх 30-секундных вспышек при 6000 об/мин, с двумя минутными периодами охлаждения на сухом льду между циклами.

Очищайте лизаты в течение 15 минут в предварительно охлаждённой микроцентрифугной трубке на максимальной скорости. После центрифугирования перенесите супернатант в чистую микроцентрифугную трубку. С помощью микропипетки перенесите небольшую часть образца в микроцентрифугную трубку для количественной оценки остаточного содержания пептидов, как описано в текстовом протоколе.

Остаток образца храните при минус 80 градусах Цельсия. Обратитесь к текстовому протоколу анализа метаболитов с помощью жидкой хроматографии и масс-спектрометрии.