Выделение эпителиальных клеток мышиного мочевого пузыря, содержащих внутриклеточные бактериальные сообщества

Начните с эпителиальных клеток мочевого пузыря, соскобленных из мышиного пузыря, инфицированного флуоресцентно меченым уропатогенным E. coli.

Во время инфекции эти бактерии проникают в эпителиальные клетки и формируют внутриклеточные бактериальные сообщества (IBC) — биопленочные структуры, которые защищают их от иммунной защиты хозяина.

Под дисекционным микроскопом идентифицируйте IBC как крупные флуоресцентные агрегаты, заключённые в отдельные эпителиальные клетки.

Соберите микропипетационную систему с использованием вытянутого стеклянного капилляра, соединённого с аспирирующей пипеткой, чтобы изолировать отдельные эпителиальные клетки с IBC.

Кратко окуньте кончик капилляра в PBS, чтобы уменьшить поглощение жидкости, управляемой капиллярами.

Разместить капилляр рядом с выбранной флуоресцентной эпителиальной клеткой и мягко всасывание, чтобы втянуть одну клетку с IBC, избегая попадания неинфицированных клеток и внеклеточных бактерий.

Выведите клетку в стерильную микроцентрифугную трубку с небольшим положительным давлением, сохраняя жизнеспособность бактерий.

Этот метод позволяет выделить эпителиальные клетки с IBC для анализа на отдельных клетках.

Когда все ячейки будут соскребли, вставьте невытянутый конец вытянутого стеклянного капилляра в резиновую пробку аспираторной трубки и плотно вставьте узкий конец наконечника пипетки объёмом 1 миллилитр в другой открытый конец трубки.

Плотно вставьте узкий конец атмосферной пипетки объёмом 2 миллилитра в открытый, широкий конец наконечника пипетки объёмом 1 миллилитр и поместите подвеску соскребшей ячейки под микроскопом. С помощью увеличения 20–40x определите IBC как крупные флуоресцентные агрегаты и окуньте тонкий конец стеклянного капилляра в свежую трубку PBS на 1 секунду, чтобы уменьшить поглощание нежелательного объёма за счёт капиллярного действия.

Когда обнаружен интересующий IBC, медленно подведите открытый конец капиллярной трубки к IBC и приложите очень малую силу всасывания к аспирирующей пипетке, чтобы направить IBC в стеклянный капилляр. Затем переместите капилляр в пустую 1,5-миллилитровую центрифугную трубку и приложите небольшое положительное давление, чтобы вывести каплю и IBC в трубку.