Визуализация окислительного стресса, вызванного патогенами, у C. elegans с использованием GFP-метированного SKN-1

Начните с двух пластин, содержащих червей C. elegans , которые экспрессируют зелёный флуоресцентный белок SKN-1 — транскрипционный фактор, локализованный в кишечной цитоплазме. Эти черви также содержат кишечные гранулы липофусцина с аутофлуоресценцией.

Одна пластина засеяна непатогенными бактериями в контрольной группе, другая — патогенными бактериями в качестве тестовой группы.

В тестовой группе перекись водорода, производимая патогеном, вызывает окислительный стресс, вызывая транслокацию SKN-1 в ядра кишечника.

В контрольной группе большая часть SKN-1 остаётся диффузно распределенной в цитоплазме.

Промыйте каждую пластину буфером и переложите червей в трубки.

Центрифуга, чтобы отделить червей и удалить буфер.

Добавьте среду с азидом натрия для анестезии.

Разместите червей на агарозных подушечках, разместите укрытия и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом. Используйте автофлуоресценцию для визуализации ядерных границ.

Сильный ядерный сигнал SKN-1 в тесте относительно диффузного цитоплазматического сигнала в контролях указывает на перелокализацию ядра и подтверждает патогенный окислительный стресс.

С помощью пипетки добавьте примерно 100 личинок L4 на каждую пластину с семенами THY стрептококка и NGM E.coli . Используйте три пластины на каждый штамм бактерий.

Инкубировать тарелки в течение 2–3 часов при 25 градусах Цельсия. После этого вынимите пластины из инкубатора. Промой их M9W и собери червей в 15-миллилитровые конические трубки.

Промой червей три раза, как делали раньше на центробежном этапе. Удалите большую часть M9W аспирацией. И добавьте 500 микролитров M9W, содержащего 2 миллимолярного азида натрия или гидрохлорида тетрамизола в червячную гранулу для анестезии.

Инкубировать трубку с червячными гранулами при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем нанесите 15 микролитров червячной суспензии на подготовленную агарозную подушечку. Под флуоресцентным микроскопом визуализируйте локализацию SKN-1 с использованием фильтров FITC и DAPI.

Изображения червей при увеличении в 10 и 20 раз. Оценивайте червей по трём уровням локализации; низкая локализация, при которой не наблюдается ядерная локализация, средняя локализация с SKN-1 BCGFP в передней или задней части червя, и высокая локализация, когда ядерная локализация SKN-1 BCGFP наблюдается во всех клетках кишечника.