0 просмотров • 4:50 мин. • July 8th, 2025
Аорта - главная артерия, несущая насыщенную кислородом кровь от сердца к телу - состоит из трех слоев, или «туник»: внутренней интимы, средней среды и внешней адвентиции. Эндотелиальные клетки или ЭК присутствуют в интиме в виде тонкого, непрерывного монослоя над поддерживающей базальной мембраной, состоящей из структурных белков, в первую очередь коллагена.
Чтобы изолировать ЭК, начните с забора свиной аорты в чашке для культивирования. Иссеките его концы и любые окружающие адгезивные ткани, чтобы предотвратить загрязнение неэндотелиальными клетками. Промойте аорту буфером, содержащим антибиотики, чтобы подавить рост микроорганизмов.
Проведите стерильный хирургический шов через аорту и завяжите один из его концов, удерживая шов в пределах просвета. Закрепите завязанный конец и втяните шов, чтобы полностью вывернуть аорту. Это подвергает ЭК-содержащую интиму ферментативному перевариванию. Обработайте аорту предварительно подогретым раствором коллагеназы с низкой концентрацией для оптимальной активности ферментов и инкубируйте.
Коллагеназа расщепляет коллагеновые белки, присутствующие в базальной мембране, лежащей под ЭК, инициируя их диссоциацию. После инкубации добавьте охлажденный буфер для инактивации ферментов коллагеназы.
Аккуратно соскребите поверхность аорты и промойте ее буфером, чтобы высвободить ЭК в раствор. Центрифугируйте этот раствор для гранулирования ECs. Повторно суспендируйте гранулу в подходящей среде. Высейте клеточную суспензию в культуральную колбу и инкубируйте. КЭ прилипают к дну колбы и разрастаются.
Для выделения эндотелиальных клеток аорты свиньи перенесите аорту свиньи в 150-миллиметровую чашку Петри в асептических условиях и аккуратно удалите оба конца сосуда. Обрежьте лишнюю ткань в месте зажатия сосуда стерильными щипцами и ножницами и используйте от 20 до 50 миллилитров свежего буфера для промывки снаружи и внутри аорты.
Далее проденьте хирургический шов через аорту, и неплотно завяжите один конец сосуда, удерживая шов в пределах просвета. Аккуратно зафиксируйте аорту возле перевязанного конца щипцами, а затем медленно потяните хирургические швы, чтобы перевернуть аорту, пока эндотелиальная поверхность аорты не обнажится.
Промойте эндотелиальную поверхность аорты три раза 10 миллилитров свежего промывочного буфера на одну промывку и поместите аорту в центрифугу объемом 15 миллилитров. Налейте на образец 10 миллилитров нагретого при температуре 37 градусов Цельсия 0,005% коллагеназы внутривенно и инкубируйте ткань при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.
В конце инкубации переложите все содержимое пробирки в 100-миллиметровую чашку для культур и остановите сбраживание с помощью от 10 до 15 миллилитров предварительно охлажденного буфера. С помощью скребка для клеток аккуратно удалите эндотелиальные клетки аорты с внутренней поверхности сосуда и трижды промойте сосуд 5 миллилитрами промывочного буфера на одну промывку.
После последней промывки переложите надосадочную жидкость в 50-миллилитровую центрифужную пробирку и дважды промойте дно чашки для культивирования 5 миллилитров свежего промывочного буфера за одну промывку, объединив промывки в 50-миллиметровой пробирке.
Соберите клетки центрифугированием и выбросьте все, кроме последних 10 миллилитров надосадочной жидкости. Добавьте 20 миллилитров промывочного буфера, чтобы повторно суспендировать гранулы, стараясь избежать образования пузырей, и соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования.
Повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитр среды для культивирования клеток для подсчета и поместите клетки в соотношении от 1 x 10 до 6 клеток на 25 см в квадрате колбы. Затем поместите клетки в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, обновляя среду каждые 2-3 дня.