Кальций-зависимая гидрофобная хроматография: метод очистки кальций-связывающих белков на основе гидрофобных взаимодействий

Кальций-зависимая гидрофобная интеракционная хроматография — это метод отделения кальций-связывающих белков от других некальций-связывающих белков в образце.

Для начала возьмем предварительно собранную хроматографическую колонку, содержащую матрицу из сшитых агарозных шариков, дериватизированных гидрофобными фенильными группами для облегчения взаимодействия с белками-мишенями. Уравновесьте его с помощью связывающего буфера, содержащего очень высокую концентрацию ионов кальция для максимального взаимодействия смолы и целевого белка при последующей загрузке образца.

Возьмите образец, содержащий диализованную белковую смесь, и добавьте в него концентрацию хлорида кальция в той же концентрации, которая используется в буфере для связывания для уравновешивания колонки. Это максимизирует связывание белка с колонкой.

Ионы кальция связываются со специфическими белками в лизате, вызывая конформационные изменения в этих белковых молекулах, обнажая их гидрофобные области.

Отфильтруйте смесь, чтобы отделить примеси и заполнители, чтобы они не засоряли колонку. Загрузите этот фильтрат в предварительно уравновешенную колонку. Белки с обнаженными гидрофобными областями взаимодействуют с соответствующими гидрофобными фенильными группами смолы.

Промойте с использованием солесодержащего связующего буфера для удаления несвязанных белков для повышения чистоты образца на последующих этапах. Пропустите через колонку буфер для элюирования, не содержащий хлорида кальция, содержащий ЭДТА - двухвалентный хелатор.

Поскольку ЭДТА хелатирует ионы кальция, гидрофобные взаимодействия между белком-мишенью и смолой нарушаются. Белки-мишени становятся подвижными и вымываются из колонки.

Чтобы продолжить очистку белка, после белкового диализа добавьте в образец хлорид кальция до конечной концентрации 25 миллимоляров, что будет способствовать связыванию S100A12 со смолой на следующем этапе. Затем отфильтруйте образец через фильтр с размером заливки 0,45 мкм.

Уравновесьте буферы и образцы HIC до 4 градусов Цельсия. Далее подключите буферы столбцов HIC-A и B и столбец, к системе и настройте параметры.

Запустите метод уравновешивания колонки с 1-2 объемами колонки буфера HIC-A и загрузите образец и «промывку несвязанного блока выборки», когда УФ-сигнал снова достигнет базового уровня.

Затем начните элюирование с помощью кальциевого хелаторсодержащего буфера ЭДТА. Соберите 2 миллилитра пиковых фракций во время элюирования.