Жидкостная хроматография с гидрофильным взаимодействием: метод разделения гидрофильных полярных аналитов с помощью гидрофильных шариков

Жидкостная хроматография гидрофильного взаимодействия, HILIC, представляет собой метод разделения гидрофильных полярных соединений на основе степени их полярности. Начните с установки колонны HILIC, наполненной гидрофильными шариками, несущими полярные функциональные группы.

Сначала кондиционируют колонну с помощью уравновешивающего буфера и подвижной фазы – смеси органического растворителя и воды. Молекулы буфера стабилизируют рН, в то время как органический растворитель насыщает колонку. Молекулы воды обездвиживают и создают водный слой над гидрофильными шариками.

Загрузите образец, содержащий смесь гликанов - гидрофильных полярных соединений - помеченную флуоресцентной меткой. Пропустите пробу с помощью подвижного фазового градиента через колонку с оптимальной скоростью потока.

По мере продвижения образца по гидрофобной подвижной фазе гликаны мигрируют в водный слой, оставляя за собой примеси. Впоследствии гликаны перемещаются к полярным функциональным группам на бусинах. Здесь более полярные гликаны связываются сильно, в то время как менее полярные связываются слабо.

По мере снижения гидрофобности подвижной фазы в первую очередь элюируются слабосвязанные гликаны с меньшей полярностью и меньшим временем удержания. И наоборот, сильно связанные гликаны с более высокой полярностью и более длительным временем удержания элюируются последними.

Наконец, детектор обнаруживает флуоресцентный сигнал элюированных фракций, соответствующий стандартным пикам гликанов на хроматограмме.

Во-первых, откройте программное обеспечение для управления мобильными фазами. Инструменты УПЛК промыть 50% растворителем В и 50% растворителем С со скоростью потока 0,2 миллилитра в минуту в течение 30 минут. Затем промыть, с 25% растворителем А и 75% растворителем Б со скоростью расхода 0,2 миллилитра в минуту, в течение 20 минут, затем, со скоростью потока 0,4 миллилитра в минуту.

Растворите меченые N-гликаны в 25 микролитрах смеси 100% ацетонитрила и сверхчистой воды в соотношении 2:1 (объем/объем). Затем центрифугируйте при 134 x g в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия и с помощью приводной трубы загрузите 10 микролитров надосадочной жидкости в инструменты UPLC.

Отделяйте меченые N-гликаны со скоростью потока 0,4 миллилитра в минуту с линейным градиентом от 75% до 62% ацетонитрила в течение 25 минут. Затем выполните аналитический прогон с помощью калибровочной лестницы декстрана/гликопептидной колонки на UPLC при температуре 60 градусов Цельсия.

Обнаружение флуоресценции N-гликана на длинах волн возбуждения и излучения 330 нанометров и 420 нанометров соответственно.