Энциклопедия экспериментов JoVE
Biological Techniques
0 просмотров • 3:24 мин. • July 8th, 2025
Аденозинтрифосфат, АТФ, основной источник клеточной энергии, жизненно важен для различных клеточных функций. При стрессе внутриклеточный уровень АТФ подвергается негативному воздействию, что делает АТФ хорошим маркером для метаболически активных, жизнеспособных клеток.
Для начала засейте суспензию опухолевых клеток в микропланшет с черными стенками и прозрачным дном для минимального рассеяния света во время измерения интенсивности света. Микропланшет состоит из гидрогелевого покрытия, которое предотвращает прилипание клеток к пластине, обеспечивая межклеточное взаимодействие и самосборку в опухолевые органоиды – трехмерные культуры тканей, имитирующие микроокружение опухоли.
Далее обработайте тестовым составом. Исследуемое соединение взаимодействует с органоидными клетками и, в зависимости от его потенциала по ингибированию роста, может нарушать энергетически продуцирующие метаболические процессы, что приводит к истощению внутриклеточной АТФ.
После обработки добавьте одноэтапный реагент, состоящий из детергентов, ингибиторов АТФазы, фермента люциферазы, специфического субстрата люциферазы, люциферина и ионов магния. Инкубируйте в течение желаемой продолжительности.
Детергент растворяет клеточные мембраны, вызывая лизис клеток и экстракцию АТФ в раствор, в то время как ингибиторы АТФазы инактивируют любые высвобождаемые эндогенные АТФазы, стабилизируя АТФ.
После экстракции АТФ, в присутствии ионов магния, способствует связыванию люциферина с люциферазой, которая окисляет люциферин до высокоэнергетического оксилюциферина, который при релаксации генерирует биолюминесцентный фотон.
С помощью люминометра измерьте интенсивность света, производимого фотонами, репрезентативную для внутриклеточной концентрации АТФ. Более низкое количество АТФ указывает на более низкую жизнеспособность клеток, что предполагает более высокий потенциал ингибирования роста исследуемого соединения.
После 24 часов смены среды измельчите опухолевые органоиды с помощью прибора для фрагментации и диспергирования клеток, оснащенного фильтродержателем, содержащим сетчатый фильтр толщиной 70 микрометров. Разведите 15 миллиметров опухолевой органоидной суспензии в 10 раз.
Используйте дозатор клеточной суспензии для посева 40 микролитров разбавленной суспензии опухолевых органоидов в 384-луночный сфероидный микропланшет со сверхнизким уровнем прикрепления.
Через 24 часа с помощью обработчика жидкостей добавьте в лунки 0,04 микролитра растворов испытуемого агента из 10 серийных разведений в конечных диапазонах концентраций от 20 микромоляров до 1,0 наномоляров и инкубируйте планшет в течение 6 дней.
По окончании инкубации добавьте в тестовые лунки внутриклеточный АТФ-измерительный реагент. С помощью миксера перемешайте содержимое тарелки и выдержите тарелку в течение 10 минут при температуре примерно 25 градусов Цельсия. Используйте планшетный ридер для измерения внутриклеточного содержания АТФ в виде люминесценции.