Колориметрический анализ для количественного определения неструктурных углеводов в тканях растений

Легкоусвояемые углеводы являются неструктурными компонентами растительной ткани и функционируют как резервный источник энергии для роста и обмена веществ растений.

Чтобы количественно определить неструктурные углеводы, возьмите отмеренное количество растительной ткани в пробирке. Добавьте в пробирку разведенную серную кислоту, и нагрейте образец. При нагревании серная кислота гидролизует полисахариды легкоусвояемых углеводов до соответствующих моносахаридных субъединиц.

Охладите образец. Центрифугируйте пробирку, чтобы гранулировать непереваренный растительный материал и получить надосадочную жидкость, содержащую моносахариды.

Отсадите надосадочную жидкость в свежую пробирку, а моносахариды обработайте раствором фенола с последующим добавлением серной кислоты. Сделайте вихревую пробирку, перемешайте содержимое и инкубируйте.

Во время инкубации серная кислота обезвоживает моносахариды с образованием производных фурфурола. Эти производные фурфурола вступают в реакцию с фенолом с образованием желто-золотого раствора.

Спектроскопически определяют поглощение желто-золотого раствора при 490 нанометрах, что соответствует содержанию углеводов в образце растения.

Затем возьмите растворы глюкозы в различных концентрациях и повторите обработку фенол-серной кислотой для получения различных интенсивностей цвета и постройте стандартную кривую. Сравните значение абсорбции неизвестного образца углеводов со стандартом глюкозы, чтобы получить содержание легкоусвояемых углеводов в растительных тканях.

Во-первых, взвесьте реплики из каждого образца ткани в стеклянные 15-миллилитровые пробирки. Наклейте этикетки на пробирки и запишите точную массу каждого образца.

Далее добавьте в каждую трубку по 1 миллилитру 0,1 молярной серной кислоты, и плотно закройте крышки. Затем поместите трубки на кипящую водяную баню на 1 час.

Переведите трубки на теплую водяную баню для остывания. Затем вылейте содержимое пробирок в промаркированные 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки. После этого центрифугируйте пробирки при 15 000 г в течение 10 минут. С помощью микропипетки перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки с маркировкой объемом 1,5 миллилитра.

С помощью пипетки перенесите по 15 микролитров каждого неизвестного образца в отдельную пробирку. Затем добавьте 385 микролитров дистиллированной воды в каждую трубку.

В вытяжной шкаф добавьте 400 микролитров 5% фенола в каждую стандартную и неизвестную пробу пробирки. Сразу после этого добавьте по 2 миллилитра серной кислоты в каждую трубку.

Обязательно добавьте серную кислоту на поверхность раствора.

После инкубации трубок в течение 10 минут сделайте трубки вихревыми. Затем инкубируйте трубку еще 30 минут.

Переложите 800 микролитров из каждой пробирки с образцом в три полистирольные полумикрокюветы объемом 1,5 миллилитра. Затем установите спектрофотометр на 490 нанометров и откалибруйте его с помощью чистой кюветы.

Наконец, пропустите каждую кювету через спектрофотометр и запишите поглощение.