Иммуноферментный анализ для верификации химически связанных конъюгатов антитело-антиген

Чтобы вызвать иммунный ответ, антигены связываются с антителами, специфичными для эндоцитарных рецепторов, присутствующих на поверхности дендритных клеток, или ДК — антигенпрезентирующих клеток, которые помогают в поглощении антигенов.

Образование комплекса антитело-антиген является важным этапом и может быть достигнуто in vitro путем химического связывания антигена с моноклональным антителом, нацеленным на DC.

Чтобы проверить эффективность процесса конъюгации, начните с планшета ИФА, предварительно покрытого захваченными антителами. Обработайте пластину блокирующим раствором, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антигенов с поверхностью покрытия.

Добавьте в планшет химически сшитые конъюгаты антитела-антиген и инкубируйте. Специфический эпитоп антигена взаимодействует с паратопом захваченного антитела, образуя комплекс антитело-антиген-антитело.

Затем наложите на пластину третий набор антител, связанных с ферментом. Эти антитела специфически связываются с первичными антителами, присутствующими в конъюгате, что позволяет его обнаруживать.

Добавьте буфер, содержащий хромогенный субстрат, чтобы визуализировать конъюгаты. Фермент, прикрепленный к антителу, вступает в реакцию с субстратом, образуя окрашенный продукт.

Обработайте пластину подкисленным раствором для инактивации, который инактивирует фермент и завершит реакцию. Проанализируйте пластину спектрофотометрически. Наличие окрашенного раствора вердиктует наличие конъюгатов антитело-антиген и подтверждает успешную конъюгацию.

Чтобы проверить успешность конъюгации методом ИФА, нанесите на соответствующий 96-луночный планшет ИФА 100 микролитров антитела против OVA на лунку и последовательно разбавьте анти-DEC-205/OVA в соотношении 1:2 в блокирующем буфере для получения разведений от 6 микрограммов на миллилитр до 93,8 нанограммов на миллилитр.

Добавьте по 100 микролитров каждого разведения в соответствующие лунки планшета, покрытого антителами, для одночасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте 100 микролитров конъюгированного антитела к пероксидазе хрена против конъюгата анти-DEC-205/OVA в планшет для одночасовой инкубации при комнатной температуре.

Затем добавьте по 50 микролитров субстрата пероксидазы хрена в каждую лунку, чтобы можно было проанализировать цветовую реакцию с помощью спектрофотометрии.