Хемилюминесцентный вестерн-блоттинг для переработки белка

CD95 – рецептор смерти – связывается со своими агонистическими антителами, запуская сборку сигнального комплекса, вызывающего смерть, или DISC – мультибелкового комплекса, который рекрутирует прокаспазу 8. В DISC прокаспаза 8 димеризуется и перерабатывается с образованием различных промежуточных продуктов расщепления и, наконец, активной формы, которая инициирует апоптоз.

Для анализа процессинга каспазы-восьми с помощью хемилюминесцентного вестерн-блоттинга берут лизат, содержащий в пробирке ассоциированные с DISC промежуточные продукты расщепления каспазы 8. Дополните это белком А-агарозными антителами против CD95, захваченными в шариках. Антитела к CD95 связываются с компонентом DISC — CD95, образуя белковые комплексы.

Загрузите образец в полиакриламидный гель SDS, чтобы разделить промежуточные продукты иммунопреципитации каспазы 8 разного размера в виде отдельных полос. Поместите гель на промокательную пленку, и подайте электрический ток. Промежуточные продукты каспазы 8 выходят из геля на блоттинговую мембрану.

Обработайте мембрану блокирующим белок-содержащим раствором, чтобы насытить белок-связывающие участки, предотвращая неспецифические связывания.

Добавьте раствор первичных антител, которые связываются с продуктами каспазы-восьми в определенном месте.

Добавьте меченые ферментами вторичные антитела, которые специфически связываются с комплементарной Fc-областью первичного антитела, чтобы сформировать комплекс продукт расщепления каспазы-восемь антител-первичное антитело-вторичное антитело.

Добавьте хемилюминесцентный субстрат, который вступает в реакцию со вторичным ферментом, конъюгированным с антителами, и излучает свет. Интенсивность излучаемого света коррелирует с величиной продукта расщепления каспазы-восьми.

Чтобы выполнить вестерн-блоттинг, добавьте в бусины 20 микролитров загрузочного буфера 4X и нагревайте при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. Одновременно нагрейте регуляторы лизата до 95 градусов Цельсия в течение 5 минут. Загрузите лизаты, иммунопреципитанты и стандартный белок в 12,5% гель SDS и запустите с постоянным напряжением 80 вольт.

После завершения прогона геля перенесите белки из геля SDS на нитроцеллюлозную мембрану. После завершения переноса поместите промокающую мембрану в коробку, и выдержите ее в течение часа в блокирующем растворе, при слабом перемешивании. Затем промойте мембрану три раза в течение 5 минут PBST.

Чтобы обнаружить белки, добавьте первое первичное антитело в указанном разведении к мембране и инкубируйте его в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия при осторожном перемешивании. На следующий день промойте мембрану тремя 5-минутными PBST-промывками, затем инкубируйте мембрану с 20 миллилитрами вторичного антитела с легким встряхиванием в течение 1 часа при комнатной температуре.

Снова трижды промойте мембрану PBST. После того, как вы выбросите последнюю промывку PBST, добавьте примерно 1 миллилитр субстрата перекиси хрена на мембрану и обнаружьте хемолюминесцентный сигнал.