Энциклопедия экспериментов JoVE
Immunology
0 просмотров • 3:16 мин. • July 8th, 2025
Начните с многолуночного планшета, содержащего суспензию дендритных клеток или ДК.
Чтобы имитировать гипертензивное состояние, добавьте питательную среду, содержащую высокую концентрацию ионов натрия, и инкубируйте.
Во время инкубации ионы натрия попадают в клетку, увеличивая внутриклеточную концентрацию натрия.
Это запускает обмен внутриклеточных ионов натрия с внеклеточными ионами кальция.
Повышенный внутренний уровень кальция активирует пути, которые способствуют образованию реактивных альдегидов, которые связываются с клеточными белками. Это активирует ДК, которые отображают эти модифицированные белки на своей поверхности.
После инкубации соберите клетки в пробирку и центрифугу.
Удалите надосадочную жидкость. Добавьте свежий буфер для ресуспендирования ячеек.
Наберите клеточную суспензию в шприц.
Возьмите мышь под наркозом и введите клеточную суспензию ретроорбитально, которая представляет собой область за глазницей.
Этот процесс введения активированных иммунных клеток называется адоптивным переносом клеток.
Пипеткой внесите 900 микролитров суспензии постоянного тока в 24-луночный плоский соколиный планшет. Добавьте 100 микролитров питательной среды DC с высоким содержанием соли в каждую лунку для получения конечной концентрации натрия 190 миллимоляр. Наклейте этикетку на тарелку и поместите ее в инкубатор с увлажненным углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 48 часов.
Через 48 часов достаньте тарелку из инкубатора. Протрите питательную среду в одной лунке вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать CD11c-положительные ДК. Перенесите всю суспензию в соответствующую пробирку объемом 1,6 миллилитра. Повторите это для каждой отдельной лунки, которая была покрыта.
Центрифугируйте все пробирки при 300 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу DC 100 микролитрами стерильного DPBS. Далее наберите раствор постоянного тока из одной из пробирок в 1-миллилитровый шприц, оснащенный полудюймовой иглой 27-го калибра.
Поместите наивного самца, 10-недельного самца, черной шестилетней мыши C57 под 2% изофлурана, чтобы достичь стабильной хирургической плоскости. Проверьте уровень анестезии при отсутствии педального рефлекса. Как только будет достигнута стабильная операционная плоскость, медленно и осторожно вводите иглу в ретроорбитальное пространство под углом примерно 30 градусов.
Медленно и плавно вводите CD11c-положительную суспензию постоянного тока. После завершения инъекции осторожно извлеките иглу для ретроорбитального пространства, следя за тем, чтобы не повредить глаз. Затем извлеките мышей из носового конуса и наблюдайте за ними в течение примерно 30 минут во время восстановления после анестезии.