Энциклопедия экспериментов JoVE
Neuroscience
0 просмотров • 3:30 мин. • July 8th, 2025
Возьмите неповрежденный глаз мыши в искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) и сделайте надрез, чтобы изолировать наглазник, содержащий сетчатку.
Лечат ферментативным раствором для удаления внутренней пограничной мембраны, обнажая нейрональные клетки.
Погрузите ткань в раствор для торможения, чтобы остановить пищеварение, и промойте, чтобы удалить излишки раствора.
Поместите ткань в специализированный инкубатор при низкой температуре, чтобы замедлить клеточный метаболизм, сохранив ткань.
Этот инкубатор включает в себя основную камеру с сеткой для крепления салфеток. Камера заполнена кислотно-ликвором, а ее температура и pH контролируются для сохранения функциональности тканей.
Чтобы устранить микробное загрязнение, aCSF закачивается в другую камеру и обрабатывается ультрафиолетовым излучением для уничтожения любых микробов.
Затем стерилизованный аCSF закачивается обратно в основную камеру.
Чтобы изолировать сетчатку, извлеките наглазник, отделите сетчатку от окружающих тканей и верните ее в инкубатор.
Для подготовки целого монтирования сетчатки следует немедленно провести энуклеацию глаз от усыпленного животного. Сделайте небольшой надрез вдоль ora serrata и поместите глазки в Ames Media или aCSF с подачей карбогена при комнатной температуре. После этого сразу же удалите роговицу, хрусталик и стекловидное тело, разрезав вдоль ora serrata маленькими ножницами, и удалите их щипцами. Поместите ткань в инкубационную систему при комнатной температуре.
Чтобы удалить внутреннюю пограничную мембрану, перенесите наглазник, содержащий сетчатку, в небольшую стеклянную банку, содержащую папаин, L-цистеин, ЭДТА и ДНКазу при температуре 37 градусов Цельсия на 20 минут. Нанесите карбоген в раствор через крышку, но не пузыритесь. Остановите ферментативное расщепление, поместив ткань в овомукоид и раствор BSA на 10 минут в BSS Earl's. Затем тщательно промойте ткань с аКСФ.
Впоследствии перенесите ткань в инкубационную систему и снизьте температуру примерно до 15-16 градусов по Цельсию. После этого перенесите ткань сетчатки в микроскоп; Изолируйте сетчатку от наглазника, и разрежьте ее на четыре части лезвием бритвы. Если требуется вся сетчатка, сделайте четыре небольших разреза на периферии сетчатки, чтобы она могла лежать ровно.
Теперь эту ткань можно перенести в микроскоп для электрофизиологии или поддерживать в Braincubator. Ткань хранится в основной камере, содержащей зонды для измерения pH и температуры. Вторая камера изолирована от основной камеры и подвергается воздействию ультрафиолетового излучения мощностью 1,1 Вт для облучения бактерий, плавающих в растворе. Используйте перистальтический насос для циркуляции aCSF через две камеры и термоэлектрическую холодную пластину Пельтье для охлаждения или нагрева основной камеры.