Генерация предшественников корковых интернейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши

Возьмите эмбриональные стволовые клетки мыши, взвешенные в бессывороточных средах, содержащих низкомолекулярные ингибиторы.

Поместите клетки на неадгезивную культуральную пластину, позволяя им размножаться и агрегировать с образованием трехмерных эмбриоидных тел или БЭ.

Кроме того, ингибиторы блокируют ненейрональные сигнальные пути и индуцируют дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в сторону корковой нервной судьбы.

Перенесите БЭ в пробирку, центрифугу и удалите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте БЭ в растворе, содержащем коктейль ферментов и ДНКазу.

Ферменты диссоциируют БЭ в отдельные клетки, в то время как ДНКаза разлагает загрязняющую ДНК.

Добавьте бессывороточные среды, содержащие ингибиторы, чтобы остановить ферментативную активность, затем центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, содержащую ферменты.

Ресуспендируйте клетки в средах, содержащих низкомолекулярные ингибиторы, и перенесите их на культуральные планшеты, покрытые факторами адгезии.

Ячейки прикрепляются к поверхности пластины с покрытием.

Ингибиторы предотвращают гибель апоптотических клеток и индуцируют клеточную дифференцировку в предшественников корковых интернейронов.

Начните выращивать клетки как эмбриоидные тела, добавив 75 000 клеток на миллилитр в среду KSRN2 в неадгезивные чашки для культивирования тканей и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия. На DD1 подготовьтесь к посадке клеток, покрыв обработанные культурой ткани чашки поли-L-лизином в течение не менее одного часа или на ночь при температуре 37 градусов Цельсия.

На DD2 аспирируйте поли-L-лизин и покройте пластины ламинином на ночь при температуре 37 градусов Цельсия. На DD3 перед началом диссоциации БЭ аспират ламинина и дайте планшетам полностью высохнуть в вытяжке для культуры тканей.

После этого перелейте БЭ со средой в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте в течение трех-четырех минут при 15-умножденной на g или пока БЭ не гранулируются. Аспирируйте среду и добавьте 3 миллилитра раствора для отслойки клеток, содержащего ДНКазу. Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Осторожно переворачивайте трубку каждые три минуты, чтобы способствовать диссоциации БЭ. Как только БЭ перестанут быть видимыми или пройдет 15 минут, добавьте 6 миллилитров KSRN2, содержащей ДНКазу, и центрифугируйте в течение пяти минут при 200-кратном избытке. Затем поместите клетки в KSRN2, содержащие LDN193189, XAV939 и ингибитор ROCK Y27632 в соотношении от 4,5 до 5 x 10 4 клеток на квадратный сантиметр.