Генерация культуры нейронов сверхнизкой плотности с использованием питательного слоя нейронов высокой плотности

Начните с двух многолуночных планшетов: один с травленым дном, покрытым полимером, а другой с полимерным покрытием.

Засейте высокоплотную суспензию эмбриональных нейронов в пластину с протравленным дном. Добавьте суспензию нейронов сверхнизкой плотности в покровную колодку, содержащую колодец.

Инкубируйте для обеспечения присоединения нейронов к полимерам.

Снимите покровную крышку и поместите ее поверх культуры нейронов высокой плотности, позволяя нейронам стоять друг против друга.

Травленая поверхность с возвышенными структурами создает микропространство, разделяющее нейроны разной плотности.

Культура высокой плотности действует как питательный слой и выделяет нейронный фактор роста.

Благодаря ограниченному диффузионному пространству факторы роста накапливаются вокруг нейронов, способствуя их росту и развитию нейронных проекций.

Введите нейробазальную среду с цитозина арабинозидом, который избирательно подавляет рост ненейрональных клеток.

Регулярно пополняйте запасы свежей нейробазальной среды для поддержания культуры нейронов.

В этой процедуре поместите 24-луночные планшеты с протравленным дном для нейронов высокой плотности в культуральный колпак. Удалите 300 микролитров предварительно подготовленной среды с помощью вакуума. Затем в тарелку насыпают 0,6 миллилитра клеточной суспензии высокой плотности при соотношении 250 000 нейронов на миллилитр.

Поместите остальные 224-луночные планшеты с покровными стеклами в капюшон для культивирования. Удалите 300 микролитров предварительно кондиционированной среды с помощью вакуума, прежде чем нанести 0,6 миллилитра клеточной суспензии низкой плотности в соотношении 10 000 нейронов на миллилитр на покровные стекла. После этого верните все на 24 лунки планшеты в инкубатор и инкубируйте в течение двух часов. После этого переверните покровные листы низкой плотности с прилипшими нейронами к культуре высокой плотности и убедитесь, что нейроны обращены друг к другу. Впоследствии верните две тарелки с кокультурой в инкубатор.

Подкармливайте сокультуры, добавляя 300 микролитров свежей кормовой среды в DIV 5. После этой первичной подкормки каждую неделю добавляйте в каждую лунку по 300 микролитров свежей кормовой среды без цитозина арабинозида. Если культура хранится более одного месяца, заменяйте половину среды свежей кормовой средой каждую неделю, по истечении одного месяца.