Энциклопедия экспериментов JoVE
Neuroscience
0 просмотров • 5:43 мин. • July 8th, 2025
Добавьте буфер в ткань мозга мыши и гомогенизируйте его, чтобы освободить клетки и микрососуды.
Далее добавьте в гомогенат раствор БСА-декстрана. Перемешайте и центрифугируйте для разделения компонентов. Выбросьте надосадочную жидкость.
Восстановите микрососуды в буфере и пропустите их через фильтр, удалив более крупные сосуды.
Теперь центрифугируйте фильтрат и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте микрососуды в буфере, содержащем ДНК.
Добавьте протеолитические ферменты для высвобождения эндотелиальных клеток и перицитов.
ДНКазы разрушают ДНК.
Добавьте буфер, содержащий БСА, чтобы остановить активность фермента. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте элементы в среде и наложите их на многолуночный планшет с матричным покрытием. Инкубируют, способствуя адгезии клеток.
Регулярно меняйте носители.
Эндотелиальные клетки образуют монослой и поддерживают рост перицитов.
Последующее пассирование клеток в перицитарных средах на многолуночном планшете, покрытом желатином, способствует росту перицитов при одновременной элиминации эндотелиальных клеток.
Начните с помещения мозга определенного свободного от патогенов четырех-шестинедельного самца мыши C57 black 6 на стерильную, сухую, безворсовую салфетку и с помощью изогнутых кончиков щипцов удалите мозжечок, стриатум и затылочные нервы. С помощью ватного тампона удалите все видимые мозговые оболочки и переверните мозговую ткань вверх ногами. Раскройте доли легкими движениями наружу и удалите все видимые кровеносные сосуды. Затем поместите мозговую ткань без мозговых оболочек в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 15 миллилитров холодного буфера для стирки B.
Чтобы гомогенизировать ткань, перенесите образец мозга в пробирку для измельчителя тканей Dounce и добавьте в пробирку от 3 до 4 миллилитров промывочного буфера B. Рассыпчатым пестиком измельчите ткань 55 раз. Затем промойте пестик промывочным буфером B и измельчите тканевую кашицу плотным пестиком 25 раз. По окончании гомогенизации поровну распределить кашицу между двумя 50-миллилитровыми тюбиками и добавить в 1,5-кратный объем холодного 30% бычьего сывороточного альбумина декстрана. Затем энергично встряхните трубочки, чтобы перемешать кашицу.
Чтобы изолировать сосудистую фракцию, осадите клетки методом центрифугирования и перенесите надосадочную жидкость в две новые пробирки. Храните гранулы в буфере для стирки B на льду. Повторно суспендируйте гранулы в трех миллилитрах холодного буфера для стирки В на льду.
Центрифугируйте собранные надосадочные жидкости и повторите этот шаг еще раз. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 3 миллилитрах буфера для стирки В. Затем объедините ресуспендированные гранулы и доведите окончательный объем суспензий объединенных клеток до 10 миллилитров с помощью свежего холодного буфера для стирки B.
Кроме того, диссоциируйте клетки с помощью 10-миллиметровой пипетки шесть раз, пока не останутся сгустки гранул, и используйте узел вакуумного фильтра и сетчатое фильтр из нейлоновой сетки для фильтрации клеточной суспензии. Поместите ситечко в чашку Петри и очистите сетку с помощью свежего буфера для промывки B и соскабливания, чтобы восстановить капилляры. Затем проведите повторную фильтрацию свежим фильтром.
Разделите фильтрат поровну между двумя пробирками и соберите ячейки центрифугированием. После удаления надосадочной жидкости объедините гранулы в одну пробирку, содержащую предварительно подогретый буфер для промывки B с ферментами, и добавьте в пробирку предварительно подогретую диспажу коллагеназы. Поместите трубку на водяную баню для встряхивания стола ровно на 33 минуты при температуре 37 градусов Цельсия, прежде чем остановить реакцию с 30 миллилитрами холодного буфера для стирки В.
Соберите клетки центрифугированием и осторожно выбросьте надосадочную жидкость. Быстро, но осторожно повторно суспендируйте гранулу в промывном буфере B шесть раз и снова центрифугируйте суспензию. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендировать гранулу в миллилитрах полной среды DMEM и засеять 2 миллилитра клеточной суспензии в полной DMEM в девяти лунках из трех шестилуночных планшетов, покрытых Матригелем.
Поместите клеточные культуры в стерильный инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 24 часа, прежде чем осторожно удалить мусор из каждой лунки, и добавьте свежую среду DMEM. Через 48 часов меняйте среду в каждой лунке каждые 48 часов. На 8-10-й день, когда клетки достигнут 100% конфлюенции, пропустите клетки в среде для культивирования паразитов на новые шестилуночные планшеты, покрытые желатином, и верните клетки в инкубатор для клеточных культур еще на 6-7 дней с мониторингом.