Мечение маркеров поверхности нервных клеток с помощью азидосахара при совместном культивировании с эндотелиальными клетками

Начните с добавления суспензии эндотелиальных клеток мозга мыши в проницаемую мембранную вставку трансвелл-планшета.

Хорошо добавьте на дно питательную среду и инкубируйте.

Факторы роста и питательные вещества в среде помогают клеткам расти как монослой.

Хорошо извлеките медиум со дна и из вкладыша.

Вымойте внутреннюю и внешнюю поверхности вкладыша, чтобы удалить мусор.

Добавьте адгезивную среду к вкладышу и перенесите вкладыш в лунку с матричным покрытием, содержащую первичные корковые нервные стволовые и прогениторные клетки, или NSPC, и инкубируйте.

Добавьте азидосахар, неестественный аналог предшественника сиаловой кислоты, в эндотелиальные клетки и NSPC и инкубируйте.

Цитокины и хемокины, секретируемые эндотелиальными клетками, способствуют росту NSPC в большие листовидные клоны.

Азидосахара встраиваются в сиалогликанные структуры на поверхности клеток NSPC, мечая гликопротеин. Это позволяет идентифицировать белки клеточной поверхности на расширенных NSPC.

Чтобы получить эндотелиальные клетки, суспендируйте клеточную гранулу BEND3 из чашки Петри размером 0,10 см при 90% слиянии с 9 миллилитрами клеточной среды BEND3. Добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии в одну проницаемую опорную вставку. Добавьте еще 2 миллилитра среды BEND3 на лунку в нижнюю камеру матрицы. Продолжайте культивировать клетки в течение одного дня при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Через сутки после нанесения покрытия ячеек во вкладыши аккуратно аспирируйте среду сначала из нижней камеры, а затем из вкладышей. Промойте лицевую сторону вставок три раза с предварительно подогретым DMEM. Вымойте внешнюю поверхность вставок путем промывки предварительно подогретым DMEM. Далее добавьте 1 миллилитр предварительно подогретого AM в одну вставку. Перенесите вкладыши в лунки с первичными корковыми клетками. Инкубируйте совместную культуру при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 12 часов.

Растворите Ac₄ManNAz в ДМСО до достижения исходной концентрации 200 миллимоляров. Извлеките из инкубатора планшет для совместного культивирования нейроэндотелия. Добавьте по 1 микролитру бульона Ac₄ManNAz в каждую нижнюю камеру и по 0,5 микролитра на каждую вставку в сокультуру. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 5 дней. Пока клетки культивируются, добавляйте 100 микролитров RM на вставку и 200 микролитров RM на нижнюю камеру, чтобы пополнять эндотелиальные и нервные клетки через день.