Энциклопедия экспериментов JoVE
Neuroscience
0 просмотров • 3:27 мин. • July 8th, 2025
Начните с размещения компонентов измельчителя на льду. Это устройство включает в себя ступку и два пестика разного диаметра.
Насыпьте в раствор охлажденный солевой буфер, а затем добавьте мозговую ткань мыши.
Буфер поддерживает осмотический баланс, сохраняя структуру и функцию клеток.
Измельчите ткань несколькими легкими движениями с помощью пестика меньшего диаметра, который механически разрезает ткань на более мелкие кусочки.
Далее ударьте пестиком большего диаметра, способствуя дальнейшему расщеплению ткани на составляющие ее клетки.
Переложите смесь в пробирку и центрифугу.
Удалите надосадочную жидкость.
Добавьте охлажденную соль в буфер и сделайте воркс, чтобы разбить клеточные комки и миелин.
Далее добавляем градиент плотности среды и центрифугу.
Из-за различий в форме и массе клетки будут селиться в нижнем слое, в то время как мусор и миелин накапливаются в верхнем слое.
Выбросьте надосадочную жидкость.
Добавьте подходящий раствор, чтобы получить многоклеточную суспензию для дальнейшего использования.
Для гомогенизации тканей добавьте 3 миллилитра предварительно охлажденного HBSS в предварительно охлажденный стеклянный раствор измельчителя тканей Dounce и перенесите половину одного из собранных мозгов в ступку. Аккуратно вымочите ткань 10 ударами пестика А, а затем 10 ударами пестика В, и переложите гомогенизированную смесь в новую 15-миллилитровую коническую трубку.
Заполните пробирку до конечного объема 10 миллилитров предварительно охлажденным HBSS для центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в 7 миллилитрах свежего HBSS с вортексированием перед удержанием образца на льду. Для удаления мусора добавьте 3 миллилитра предварительно охлажденного изотонического раствора в каждый переваренный или гомогенизированный образец и осторожно перемешайте образцы, чтобы убедиться, что они однородно перемешаны.
Далее центрифугируйте образцы и аккуратно удалите белесый диск из мусора и миелина, плавающий на поверхности раствора. Когда мусор будет выброшен, соберите все, кроме последних 100 микролитров надосадочной жидкости из каждой пробирки, не повреждая гранулы. Ресуспендируйте каждую гранулу в 1 миллилитр раствора FACS/BL для переноса в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.
После центрифугирования раствором частиц важно очень осторожно удалить диск мусора и надосадочную жидкость, не смещая клеточную гранулу, чтобы избежать потери пробы.
После центрифугирования осторожно отасуньте надосадочную жидкость из каждой пробирки и повторно суспендируйте гранулы в 350 микролитрах свежего FACS/BL на пробирку.