Выделение ганглиозных клеток сетчатки мыши с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией

Поместите мышиную сетчатку на увлажненное клеточное ситечко и мацерируйте круговыми движениями, чтобы отделить клетки сетчатки от внеклеточного матрикса.

Переложите фильтр в сборную трубку.

Добавьте фосфатный буфер и раствор сыворотки в ситечко для промывания и сбора клеток.

Центрифуга для отстаивания клеток. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в фосфатном буфере и растворе сыворотки.

Добавьте блокирующие антитела, которые связываются с Fc-рецепторами на клетках, предотвращая неспецифическое связывание антител-мишеней.

Затем добавьте флуоресцентно помеченные и немеченные первичные антитела, которые связываются с определенными маркерами клеточной поверхности на различных типах клеток.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Добавьте флуоресцентно помеченное вторичное антитело для связывания с немеченным первичным антителом.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Выполните флуоресцентно-активируемую сортировку клеток, или FACS, чтобы улавливать отчетливые флуоресцентные сигналы меченых клеток и сортировать ганглиозные клетки сетчатки из различных популяций клеток сетчатки.

Поместите до 12 сетчатки на стерильный 70-микронный нейлоновый фильтр, смоченный PBS и FBS, и аккуратно мацерируйте сетчатку тыльной стороной поршня шприца объемом 10 миллилитров круговыми движениями. Когда все клетки будут диссоциированы, поместите сетчатый фильтр на полипропиленовую сборную трубку и с помощью пипетки P1000 отфильтруйте клетки через сетчатый фильтр в сборную трубку.

Промойте ситечко с помощью PBS и FBS, собрав средство для мытья в сборной трубке. Добавьте достаточное количество PBS плюс FBS, чтобы довести конечный объем до 1 миллилитра раствора на сетчатку, и соберите клетки путем центрифугирования. Затем ресуспендируйте гранулу в PBS плюс FBS в концентрации 1 миллилитр среды на 5 сетчатки. Затем заблокируйте связывание любого неспецифического рецептора FC в каждой пробирке с помощью 1 микролитра антитела против мыши CD16/32 на 1 x 10⁶ клеток в течение 10 минут при комнатной температуре.

В конце блокирующей инкубации добавьте интересующий коктейль антител в клетки с помощью щадящего пипетирования в течение 30-минутной инкубации на защищенном от света льду. Затем промойте клетки два раза в 4-миллилитровом окончательном объеме PBS и FBS. Пометьте клетки соответствующим вторичным антителом в течение еще 30 минут на защищенном от света льду, после чего последует 2 промывки в PBS плюс FBS, и загрузите пробирку с образцом на проточный цитометр.