Энциклопедия экспериментов JoVE
Neuroscience
0 просмотров • 3:29 мин. • July 8th, 2025
Возьмем, к примеру, индуцированные плюрипотентными стволовыми клетками человека, или иПСК, колонии, культивируемые на пластине, покрытой внеклеточным матриксом.
ИПСК генетически модифицированы для экспрессии факторов транскрипции, которые индуцируют дифференцировку моторных нейронов.
Удалите среду и добавьте ферменты, чтобы отделить колонии.
Механически диссоциируйте клетки в одноклеточную суспензию и соберите их.
Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте клетки в средах, содержащих ингибитор, предотвращающий клеточный апоптоз.
Выложите клетки на тарелку с матричным покрытием.
Добавьте свежие дифференцировочные среды, содержащие антибиотик доксициклин и низкомолекулярные ингибиторы.
Доксициклин индуцирует экспрессию транскрипционного фактора, в то время как ингибиторы блокируют специфические сигнальные пути, способствуя дифференцировке iPSC в предшественники моторных нейронов.
Добавьте ферменты, чтобы отделить клетки.
Соберите клетки и механически диссоциируйте их.
Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в нейронной среде.
Поместите клетки на микрослайды, покрытые белками адгезии, чтобы способствовать адгезии клеток.
Факторы роста в средах индуцируют созревание предшественников в моторные нейроны.
Для дифференцировки моторных нейронов диссоциацию стабильно трансфицированных клеточных культур с помощью диссоциационного реагента, как показано, позволяет собрать клетки в 15-миллилитровую пробирку, содержащую 5 объемов среды DMEM/F12. После центрифугирования клетки ресуспендируют в среде iPSC человека с добавлением микромолярного ингибитора ROCK для подсчета.
Засейте клетки на чашках с матричным покрытием с плотностью 6,25 x 10 4 клетки на квадратный сантиметр. В течение следующих двух дней замените надосадочную жидкость свежей дифференцировочной средой с добавлением доксициклина.
На второй день замените среду на нейробазальную среду B27 с добавлением ингибитора гамма-секретазы, ингибитора рецептора фактора роста эндотелия сосудов и доксициклина. На пятый день диссоциируйте клетки, как показано на рисунке, и повторно суспендируйте отделенные клетки в 4 миллилитрах среды DMEM/F12 для подсчета.
Пипетирование имеет важное значение для полной диссоциации клеток.
Заморозьте аликвоту предшественников моторных нейронов в среду для замораживания клеток в соответствии с инструкциями производителя, а остальные клетки соберите центрифугированием. Ресуспендировать гранулу в нейрональную среду с добавлением 10 микромолярного ингибитора ROCK.
Засейте клетки на микрослайды, покрытые полиорнитином ламинином, с полимерными покровными стеклами с плотностью 1 x 105 клеток на квадратный сантиметр. На шестой день осторожно замените среду свежей нейронной средой без ингибитора для культивирования до последующего анализа, не отрывая клетки от опорной поверхности.