Фотостимуляция и запись с помощью целоклеточного зажима нейронов в срезах гиппокампа мыши

Возьмите иммобилизованный трансфицированный срез мозга мыши в камере электрофизиологической записи, перфузированной кислородосодержащим аКСФ.

Этот срез содержит окончания аксонов нейронов таламуса, экспрессирующие светочувствительные ионные каналы, слитые с флуоресцентным белком.

Визуализируйте аксоны флуоресцентных таламических нейронов и выберите пирамидальный нейрон.

Продвигайте записывающую пипетку, содержащую электрод во внутриклеточном растворе, по направлению к выбранному нейрону с небольшим положительным давлением.

Положительное давление создает ямочку на мембране нейронов при контакте.

Сбросьте давление, чтобы сформировать высокопрочное уплотнение.

Установите потенциал мембраны на постоянное отрицательное значение.

Подайте импульс отрицательного давления, чтобы разорвать мембрану, достигнув цельной клеточной конфигурации.

Освещайте окончания аксонов, активируя светочувствительные каналы и деполяризуя нейронные мембраны, запуская потенциалы действия.

Высвобождаются возбуждающие нейротрансмиттеры, связывающиеся с рецепторами на записанном нейроне, вызывая приток катионов.

Запишите возникающие возбуждающие постсинаптические токи, указывающие на прямую синаптическую связь между нейронами.

Чтобы выполнить запись с помощью целоклеточного зажима, аккуратно перенесите срез мозга, содержащий комплекс гиппокампа, в записывающую камеру. Непрерывно перфузируйте записывающую камеру с температурой 34 градуса Цельсия ACSF, пузырчатую с карбогеном со скоростью от 2 до 3 миллилитров в минуту. Кратко рассмотрим экспрессию хроноса GFP в терминалах аксонов в интересующей области с синей светодиодной подсветкой при 4-кратном увеличении.

Переключитесь на объектив с 63-кратным погружением и отрегулируйте фокус. Проверьте наличие аксонов, экспрессирующих Chronos GFP, и выберите пирамидальный нейрон для записи патчей. Далее наполните пипетку внутренним раствором на основе глюконата калия. Установите его в держатель для пипетки на головном столике. Заплатите ячейку в конфигурации клещей напряжения.

Подойдите к выявленному нейрону и деликатно прижмите кончик пипетки к соме. Положительное давление должно давать ямочку на поверхности мембраны. Затем сбросьте давление, чтобы создать гигаомное уплотнение. После запечатывания установите напряжение удержания на значение минус 65 милливольт.

Разорвите мембрану резким пульсом отрицательного давления. Запись в токе или напряжении постсинаптических откликов на 475 нанометровую стимуляцию всего поля светодиода афферентных волокон, экспрессирующих хронос. Стимулируйте с помощью серии из 10 стимуляций продолжительностью 2 миллисекунды с частотой 20 герц.