Измерение нейронной активности в срезе мозга мыши после длительной инкубации

Закрепите срез мозга мыши в записывающей камере, перфузированной кислородосодержащей aCSF после длительной инкубации.

Клетки в срезе загружены индикатором кальция, облегчающим внутриклеточное измерение кальция.

Возьмите записывающую пипетку, содержащую электрод в растворе электролита.

Определите целевой нейрон. Расположите записывающую пипетку с положительным давлением на клеточную мембрану, создав ямочку.

Приложите отрицательное давление, чтобы создать герметичное уплотнение.

Далее применяются импульсы отрицательного давления, разрывая мембрану и создавая конфигурацию целой клетки.

Перфузируют aCSF с высокой концентрацией калия, который деполяризует мембрану нейрона.

Деполяризация открывает натриевые каналы, запуская потенциал действия, который, в свою очередь, активирует потенциал-зависимые кальциевые каналы и обеспечивает приток кальция.

Ионы кальция связываются с индикатором, усиливая флуоресценцию, которую можно визуализировать при подходящем освещении.

Увеличение внутриклеточной флуоресценции, вызванное притоком кальция после применения калия, указывает на жизнеспособность нейронов после длительной инкубации.

Для записи поместите ткань в погружную записывающую камеру под микроскопом и перфузируйте ее оксигенированным aCSF со скоростью потока от 4 до 5 миллилитров в минуту. Удерживайте салфетку с помощью изготовленной на заказ арфы. Затем подготовьте несколько записывающих пипеток с помощью съемника микропипеток для достижения конечного сопротивления от 5 до 6 мегаом.

Наполните пипетку от 3 до 4 микролитров внутреннего раствора, а затем поместите раствор на лед. Затем визуализируйте ячейки с помощью ПЗС-камеры под управлением IR-DIC. Расположите пипетку на клеточной мембране с помощью микроманипулятора. Поддерживайте положительное давление через всасывающее отверстие на держателе пипетки. Как только пипетка окажется на элементе, приложите к ней мягкое отрицательное давление, чтобы добиться гигаомного уплотнения.

Затем разорвите клеточную мембрану с кратковременным отрицательным давлением. Затем начните запись тока или напряжения на всей ячейке. Для одной длины волны возбуждения потока 4 отфильтруйте возбуждающий свет через полосовой фильтр с длиной от 460 до 490 нанометров, а излучаемый свет — через полосовой фильтр от 515 до 550 нанометров.