Энциклопедия экспериментов JoVE
Neuroscience
0 просмотров • 2:42 мин. • July 8th, 2025
Поместите живой нервно-мышечный препарат личинок дрозофилы в записывающую камеру, содержащую физиологический раствор, не содержащий кальция.
Личиночные нейроны экспрессируют светочувствительный катионный канал.
Перейдите на физиологический раствор с добавлением кальция, содержащий флуоресцентный краситель.
Краситель слабо флуоресцирует в неинтернализованном состоянии, но сильно при интернализации нейронами.
Подсвечивайте личинку синим светом.
Это активирует канал, индуцируя приток катионов и деполяризацию нейронов, инициируя потенциал действия.
Потенциал действия достигает синаптического окончания в нервно-мышечном соединении, обеспечивая приток кальция и везикуловый экзоцитоз.
Впоследствии мембрана, связанная с красителем, интернализуется во время переработки везикул.
Умойтесь солевым раствором, не содержащим кальция, чтобы остановить повторение везикул и удалить любой невнутренний краситель.
Визуализируйте сигнал флуоресценции.
Затем введите не содержащий красителей кальций физиологический раствор и снова осветите.
Это индуцирует другой потенциал действия, приток кальция и экзоцитоз везикул-содержащих красителей.
Снова визуализируйте сигнал.
Выделение красителя за счет везикулярного экзоцитоза снижает флуоресценцию по сравнению с состоянием при интернализации везикул.
Для стимуляции каналродопсина прикрепите синий светодиод к программируемому стимулятору с помощью коаксиального кабеля и поместите светодиод в порт камеры. Сфокусируйте синий светодиодный луч света на препарате с FM-красителем с помощью функции микроскопа Zoom.
Наиболее важным шагом на этом этапе процедуры является обеспечение постоянной настройки светодиодов и освещение одной и той же части тела каждого животного для всех сравниваемых условий, чтобы обеспечить постоянную силу стимуляции.
Запустите световую стимуляцию и отслеживайте с помощью таймера заданную продолжительность периода оптогенетической стимуляции. Когда таймер остановится, быстро удалите раствор красителя FM и замените его физиологическим раствором, не содержащим кальция, чтобы остановить цикл SV. Для выгрузки FM-красителя запустите световую стимуляцию и отслеживайте с помощью таймера заданную продолжительность периода оптогенетической стимуляции. Когда период таймера закончится, быстро удалите раствор красителя FM и замените его физиологическим раствором, не содержащим кальция, чтобы остановить цикл SV.