Анализ динамики кальция и изменений мембранного потенциала в эндотелии артериол мыши

Закрепите артериолярную эндотелиальную трубку, собранную из мозга мыши, в камере с непрерывным буферным потоком.

Поместите камеру в записывающую установку.

Введите чувствительный к кальцию флуоресцентный краситель. Инкубируйте, чтобы дать возможность клеткам усвоить краситель.

Умойтесь, чтобы удалить любой невнутренний краситель.

Вставьте электрод в эндотелиальную клетку и зарегистрируйте потенциал мембраны покоя.

Увеличьте температуру ванны до физиологической температуры, чтобы облегчить внутриклеточное связывание кальция с красителем.

Возбуждайте краситель и измеряйте флуоресценцию для количественного определения исходного уровня кальция в клетках.

Введите препарат, который связывается со специфическими рецепторами, связанными с G-белком, на эндотелиальных клетках, инициируя сигнальный каскад

.

Этот каскад высвобождает ионы кальция из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму, усиливая связывание кальция с красителем и флуоресценцию.

Повышенный уровень кальция в цитоплазме также активирует калиевые каналы, способствуя оттоку ионов калия и уменьшая мембранный потенциал.

Запишите данные.

Повышенная флуоресценция и снижение мембранного потенциала указывают на функциональную эндотелиальную трубку.

Чтобы измерить потенциал эндотелиальной мембраны, глядя через четырехкратный объектив, осторожно поместите острый кончик электрода прямо над клеткой артериальной эндотелиальной трубки в текущий физиологический раствор соли с помощью микроманипулятора. Постепенно увеличивайте увеличение до 400 раз и при необходимости перемещайте наконечник электрода. С помощью микроманипулятора аккуратно введите наконечник острого электрода в одну из ячеек эндотелиальной трубки, и начните запись ВМ с помощью электрометра.

Как только эндотелиальная ВМ в состоянии покоя стабилизируется от минус 30 до минус 40 милливольт, применяйте желаемые фармакологические средства для каждой экспериментальной цели. Загрузите в эндотелиальную трубку флуоресцентный трекер для плазматической мембраны или желаемой органеллы при температуре 37 градусов Цельсия на 15–30 минут. Промойте клетки свежим раствором физиологической соли для суперфузии и визуализируйте живые клетки под микроскопом на длине волны возбуждения соответствующих красителей.