Энциклопедия экспериментов JoVE
Neuroscience
0 просмотров • 3:18 мин. • June 17th, 2025
Возьмем первичные корковые нейроны грызунов, культивируемые на стеклянной чашке со стеклянным дном, содержащей среду.
Эти клетки экспрессируют генетически кодируемый ALS-ассоциированный белок и биосенсор кальция.
Замените среду буфером с низким содержанием хлорида калия.
Инкубируйте для поддержания активности нейронов в состоянии покоя и исходного уровня кальция.
Установите чашку на предметный столик для конфокального микроскопа и расположите перфузионную трубку.
Используя светлопольное освещение, сосредоточьтесь на нейронах, затем переключитесь на флуоресцентную визуализацию.
С помощью лазера микроскопа возбуждайте биосенсор и регистрируйте флуоресцентное излучение, чтобы определить исходный уровень внутриклеточного кальция.
Далее профузируйте посуду буфером с высоким содержанием хлорида калия.
Высокая концентрация калия деполяризует нейроны, открывая потенциал-зависимые кальциевые каналы в пресинаптических окончаниях. Это обеспечивает приток кальция, который инициирует синаптическую активность нейронов.
Повышенное внутриклеточное содержание кальция связывается с биосенсором, вызывая конформационное изменение, которое усиливает флуоресценцию.
Продолжайте записывать флуоресценцию, чтобы измерить изменения внутриклеточного уровня кальция в режиме реального времени, выявляя нейрональную синаптическую активность.
Через 48 часов после трансфекции GCaMP6m инкубируйте первичные нейроны коры головного мозга грызунов с низким содержанием хлорида калия ACSF в течение 15 минут. Затем установите тарелку на платформу визуализации и визуализируйте флуоресценцию GCaMP6m с помощью фильтра FITC и объектива с 20-кратным или 40-кратным увеличением. После выбора поля изображения и обеспечения идеальной фокусировки сделайте одно неподвижное изображение с ярким полем FITC и флуоресцентными маркерными каналами, чтобы обозначить границы нейронов.
Затем запустите команду «Run now» в программном обеспечении для сбора данных и выполните базальную запись в течение трех-пяти минут. Затем перфузируйте ACSF, содержащий 50 миллимоляров хлорида калия, в нейроны, как было показано ранее, и записывайте в течение пяти минут. Когда получение изображения прекратится, сохраните эксперимент и перейдите к анализу данных с помощью конфокального программного обеспечения.
Для анализа изображений откройте покадровую съемку изображений и конфокальную программу и выровняйте изображения, нажав «Изображение», затем «Обработка», а затем «Выровнять текущий документ». Затем выберите Выровнять по первому кадру. Выберите интересующие области вдоль нейритов с помощью инструмента выбора ROI, а также отметьте ROI, представляющий интенсивность фоновой флуоресценции. Затем запустите функцию измерения на панели измерения времени, чтобы измерить исходную флуоресценцию с течением времени для выбранных ROI. После измерения экспортируйте исходные интенсивности флуоресценции в программное обеспечение для работы с электронными таблицами.