Подготовка гистологических образцов для световой микроскопии

Гистология — это термин, который относится к изучению микроскопического строения тканей и клеток. Правильная гистологическая подготовка образцов для световой микроскопии имеет решающее значение для получения качественных результатов анализа тканей.

Существует 3 основных этапа, общих почти для всех гистологических процедур. Во-первых, образец фиксируют, чтобы сохранить структуру ткани и замедлить её деградацию. Затем образец погружают в материал, или среду для заливки, который обладает схожими с тканью механическими свойствами. После заливки образец подвергают секционированию, то есть нарезают на тонкие срезы с помощью прецизионного режущего инструмента, называемого микротомом. В этом видео описываются эти общие этапы и некоторые связанные с ними концепции.

Фиксация тканей является критически важным этапом, который позволяет сохранить клеточные и тканевые компоненты и поддерживать их структуру. После гибели клетки из клеточных органелл высвобождаются естественные ферменты, которые начинают расщеплять белки во всей клетке и во внеклеточном матриксе, тем самым разрушая структуру клетки. Фиксация предотвращает такую деградацию путем прямого ингибирования способности этих ферментов переваривать белки и путем того, что делает сайты расщепления ферментов неузнаваемыми.

Двумя основными механизмами фиксации являются сшивание и коагуляция. Сшивание включает образование ковалентных связей как внутри белков, так и между ними, что вызывает уплотнение ткани и, следовательно, ее устойчивость к деградации. Коагуляция вызвана дегидратацией белков с использованием спиртов или ацетона, которые деформируют третичную структуру белка так, что гидрофобные, или водоотталкивающие, области перемещаются на поверхность белка. Коагуляционная фиксация может способствовать проникновению среды для заливки, такой как парафин, в ткань.

Одним из наиболее часто используемых фиксаторов является формалин, который представляет собой формальдегид, растворенный в воде. В процессе фиксации формальдегид присоединяется к первичным аминам, таким как амины в боковых цепях аминокислот лизина и глутамина, образуя стабильную поперечную связь, называемую метиленовым мостиком. Этот процесс по своей природе медленный и может занимать до 1-2 дней.

Перед началом фиксации следует учесть несколько факторов. Во-первых, рассмотрите диффузионную способность образца. Фиксаторы диффундируют сквозь ткани на расстояние, скорость которого зависит от коэффициента диффузии фиксатора, умноженного на квадратный корень из времени. Фиксатору, которому требуется 1 hour для проникновения на 1 mm в образец, потребуется 25 hours для проникновения на 5 mm. После того как формалин достигнет центра ткани, все еще должна произойти реакция сшивания. Таким образом, для тщательной фиксации за разумное время толщина образца должна быть ограничена 4 mm.

Во-вторых, рассмотрите объем и pH фиксатора. Соотношение объема фиксатора к объему образца должно составлять не менее 40:1, чтобы реагент не истощался слишком быстро с течением времени. В то время как некоторые фиксаторы предназначены для работы при кислом pH, формалин лучше всего работает при фосфатной буферизации для поддержания нейтрального pH, чтобы не образовывался избыток кислоты, который вызывает артефакты в ткани.

Следующим этапом гистологической подготовки является заливка, которая заключается в помещении образцов в среду, обладающую механической жесткостью, схожей с жесткостью самого образца. Выбор подходящей среды для заливки имеет решающее значение, так как при избыточной жесткости или недостаточной прочности среды при микротомировании могут возникнуть дефекты. Самым распространенным средством для заливки является парафин.

Перед заливкой в парафин образцы должны быть обезвожены путем замены воды в тканях сначала этанолом, затем ксилолами и, наконец, теплым расплавленным парафином. После того как парафин инфильтрировал образец, его осторожно помещают в форму и заполняют дополнительным парафином для создания блока. Затем образцы закрепляют в гистологической кассете для последующего микротомирования.

Микротомирование — это процесс нарезания тонких срезов образца из залитого блока. Для использования в световой микроскопии толщина срезов обычно составляет 4-10 µm.

Для нарезания срезов на микротоме сначала закрепляют металлический, стеклянный или алмазный нож. Затем образец помещают в держатель. После этого образец подводят к режущей поверхности и перемещают вдоль ножа для получения среза нужной толщины. Срезы собираются в виде тонких лент, которые затем можно перенести на предметные стекла.

После микротомирования образцы помещают на стекла. В случае с образцами, залитыми в парафин, срезы сначала помещают в теплую водяную баню, после чего их поднимают из воды на предметное стекло и оставляют до высыхания.

Биологические ткани обладают очень низким собственным контрастом, поэтому после гистологической обработки срезы обычно окрашивают красителями или антителами, которые подчеркивают морфологию или специфические белки. Наиболее распространенным методом окрашивания является окраска гематоксилином и эозином, или H&E. Из-за широкого применения этого метода было создано множество автоматических приборов для воспроизводимого окрашивания большого количества срезов H&E. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, а эозин — цитоплазму в розовый, что позволяет выявить клеточную морфологию тканей.

Одним из недостатков фиксации является то, что сшивание белков может затруднить поиск сайтов связывания для маркирующих антител. Вместо использования фиксации для сохранения образцов можно применять быстрое замораживание тканей, или шоковую заморозку, за которой следует метод получения срезов, называемый криосекционированием.

Образцы тканей заливают и ориентируют в специальной среде для замораживания, называемой OCT (оптимальная температура резания — optimal cutting temperature medium), после чего быстро замораживают. Как и другие среды для заливки, OCT соответствует жесткости образца.

Для получения замороженных срезов используется криомикротом или криостат; этот прибор поддерживает внутреннюю температуру -20°C, чтобы лезвие и образцы оставались охлажденными. В отличие от срезов, залитых парафином, замороженные срезы можно переносить непосредственно на положительно заряженное предметное стекло сразу после секционирования.

Другим способом избежать фиксации является заливка в агар, при которой образцы покрывают свежеприготовленным жидким агарозом. По мере охлаждения агароз фиксирует ткань на месте, а излишки агароза можно обрезать.

Вибротомы, являющиеся еще одной альтернативой микротому, оснащены вибрирующим лезвием, которое перемещается по образцу, залитому в агароз. Вибротомы используются для создания толстых срезов размером от 50-1000 µm из образцов, залитых в агароз.

Обычно образцы извлекают из агароза перед окрашиванием, а затем помещают на предметное стекло, окружая их таким веществом, как вакуумная смазка, которая предотвращает сдавливание образца покровным стеклом. Для получения изображений каждого толстого среза с высоким разрешением такие препараты лучше всего изучать с помощью конфокальной микроскопии.

Вы только что посмотрели видео JoVE по подготовке гистологических образцов для световой микроскопии.

Теперь вы должны понимать этапы подготовки образцов, которые позволяют пройти путь от фрагмента ткани до готового к окрашиванию среза. Как всегда, спасибо за просмотр!