JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Neuroscience
0 görüntülenme • 2:58 dk. • August 29th, 2025
Kortikal nöronlara farklılaşma için hazırlanmış kök hücre türevli nöronal progenitör hücrelerin yapışık bir kültürüyle başlayın.
Ortamı çıkarın, ardından hücre dışı matrisi bozmak ve hücreleri ayırmak için bir enzim ekleyin.
Enzimi nötralize etmek için bir inhibitör kullanın, ardından taze bir ortam ekleyin.
Süspansiyonu bir tüpe, santrifüje aktarın ve hücreleri izole etmek için süpernatanı atın.
Beyin dokusuna nakli kolaylaştırmak için hücreleri bir bazal membran matrisinde yeniden süspanse edin, ardından bunları soğuk bir kılcal tüpe yükleyin.
Bir ortam içeren bir transwell düzeneğine bir insan kortikal dilimi alın.
Ortamın bir kısmını çıkarın, ardından hücre süspansiyonunun damlacıklarını dokuya enjekte edin.
Matrisin katılaşmasına izin vermek için inkübe edin.
Dokuyu daldırmak için bir ortam ekleyin, ardından progenitör hücrelerin nöronlara farklılaşmasını, nöritlerini uzatmasını ve konakçı kortikal nöronlarla sinapslar oluşturmasını sağlamak için inkübe edin.
Kortikal dilim artık analiz için hazırdır.
Ortamı hücre kültürü şişesinden çıkarın. Farklılaşmanın yedinci gününde, 500 mikrolitre tripsin ekleyerek kortikal olarak astarlanmış GFP-lt-NES hücrelerini ayırın ve oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika inkübe edin.
Daha sonra, eşit miktarda tripsin inhibitörü ve ardından beş mililitre DDM ortamı ekleyin. Hücreleri yeniden süspanse edin, hücre süspansiyonunu yavaşça 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 300 G'de beş dakika santrifüjleyin. Bu arada, insan dokusunu içeren plakayı inkübatörden davlumbaza aktarın ve ek parçanın üstünden iki mililitre ortam çıkarın. Santrifüjlemenin sonunda, süpernatanı çıkarın, hücreleri soğuk, saf, bazal membran matrisinde yeniden süspanse edin ve süspansiyonu daha küçük bir tüpe aktarın.
Hücre süspansiyonunu, emme için kauçuk bir emzik üzerine bağlı soğuk bir cam kılcal damar içine toplayın. Yarı kuru doku dilimini çeşitli bölgelerde bıçaklayarak hücre süspansiyonunu küçük damlalar halinde enjekte edin. Jelenin 37 santigrat derecede 30 dakika katılaşmasına izin verin.
Daha sonra, plakayı inkübatörden tekrar davlumbaza aktarın ve dokuyu tamamen batırmak için ekin üstüne dikkatlice iki mililitre insan yetişkin kortikal ortam ekleyin.