JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Microbiology
0 görüntülenme • 3:20 dk. • September 26th, 2025
Mikroakışkan bir pompaya bağlı jelatin kaplı bir kanal slaytını mikroskop tablasına yerleştirin.
Slayt, hücre yüzeyinde bir glikoprotein olan von Willebrand faktörü veya VWF dizileri ile akan ortam altında kültürlenmiş birincil insan endotel hücrelerini içerir.
Bu sicimler, hücrelerin histamin ile uyarılmasıyla üretilir.
Mikroakışkan pompa aracılığıyla uygulanan kontrollü ortam akışı, VWF salgılanmasını ve çözülmesini destekler. Bu, VWF dizelerindeki belirli bağlama alanlarını ortaya çıkarır.
Medya akışını durdurun, yeşil bir florofor konjuge VWF'ye özgü antikor ekleyin ve dizileri antikorla etiketlemek için akışa devam edin.
Medya akışını duraklatın ve kırmızı floresan protein eksprese eden pnömokok bakterilerini tanıtın.
Bakterileri dağıtmak için akışı yeniden başlatın ve yüzey adezinleri yoluyla açıkta kalan alanlara bağlanmayı sağlayın.
Floresan mikroskobu kullanarak dizilere gerçek zamanlı bakteri bağlanmasını görselleştirin.
Medya akışını durdurun ve endotel hücrelerine bakteri bağlanmasını ölçmek için Z-yığını görüntüleri elde edin.
Mikroskobik görselleştirme için akışkan üniteyi 37 santigrat derecelik ısıtma odasına yerleştirin. Kanal slaytını önceden ısıtılmış bir mikroskobun tablasına yerleştirin.
Akış dolaşımına histamin ve bakteri enjeksiyonundan önce hücre morfolojisini ve HUVEC tabakasının bütünlüğünü kontrol edin. Akış ayarını koruyun. Perfüzyon tüpünde dolaşan ECGMS ortamına bir enjeksiyon portundan 136 mikrolitre 100 milimolar histamin stok çözeltisi enjekte ederek endotelyal canlı Palade gövdelerinden VWF salınımını indükleyin.
Multimerize VWF dizilerinin immünofloresan tespiti için, dolaşımdaki 13.6 mililitre ECGMS ortamına 200 mikrolitre PBS hacminde 20 mikrogram VWF'ye özgü FITC konjuge antikor enjekte edin. HUVEC hücre yüzeylerinde üretilen VWF dizilerine Pnömokok bağlanmasını ölçmek için, enjeksiyon portunu kullanarak EKGMS ortamına maksimum bir mililitre hacimde Pnömokok eksprese eden mililitre RFP başına sekizinci CFU'ya 1.35 kez 10 kez enjekte edin. Mikroskop büyütme için 63 kat yağa daldırma objektifi seçin ve mikroskop yazılımındaki floresan filtre ayarlarını, Pnömokok eksprese eden RFP'nin tespiti için 540 nanometre algılama filtresiyle RFP kanalına ayarlayın.
VWF dizilerine bakteri bağlanmasının nicelleştirilmesi için, her biri yaklaşık 10 morfolojik olarak bozulmamış HUVEC içeren en az 30 temsili alan görünümünden oluşan Z yığınlarının anlık görüntülerini oluşturun ve Pnömokok miktarını sayın.