Zebra Balığı Embriyolarında Biyomateryalle İlişkili Bakteriyel Enfeksiyonun Floresan Görüntülemesi

Biyomateryalle ilişkili enfeksiyonu in vivo olarak modellemek için floresan etiketli patojenik bakterilerle enjekte edilen anestezi uygulanmış zebra balığı embriyolarıyla başlayın.

Uygun filtrelerle donatılmış bir stereo floresan mikroskobun sahnesine anestezik içeren bazal ortam içeren bir Petri kabı yerleştirin.

Embriyoları görüntüleme için hareketsiz hale getiren viskoz bir ortam oluşturmak için tabağa metilselüloz çözeltisi ekleyin.

Tek tek embriyoları metilselüloza aktarın ve enjeksiyon bölgesinin görünür olduğundan emin olarak yatay olarak hizalayın.

Parlak alan filtresini kullanarak, enfekte bölgeyi hedeflemek için enjeksiyon bölgesine odaklanın.

Enfeksiyon dinamiklerini üç boyutlu olarak yakalamak için Z-yığını görüntüleme parametrelerini ayarlayın ve farklı derinliklerde floresan görüntüler elde edin.

Yazılım kullanarak, floresan yoğunluğunu ölçmek ve bakteri dağılımını izlemek için zaman içinde yakalanan görüntüleri analiz edin.

Bu protokol, biyomateryale maruz kalan ve olmayan canlı embriyolarda enfeksiyon ilerlemesinin doğrudan karşılaştırılmasını sağlar.

Stereo floresan mikroskop aşamasına %0,02 trikain ile desteklenmiş E3 ortamı içeren 100 milimetrelik bir Petri kabı yerleştirin ve Petri kabına 500 mikrolitre %2 metilselüloz ekleyin. Floresan mikroskobu ile enfeksiyonun ilerlemesini izlemek için, uygun parlak alan ve floresan filtreleri donatın, anestezi uygulanmış enfekte embriyoları bir Petri kabındaki bir metilselüloz noktasına yatay olarak hizalayın.

Enjekte edilen hasarlı dokuyu 160x büyütmede odaklamak için parlak alan filtresini kullanın. Art arda üç görüntünün kaydedilmesine izin vermek için Z yığını derinliğini 10 mikrometreye ve adım boyutunu beş mikrometreye ayarlayın. Ardından, tek tek embriyoları aynı optimize edilmiş ayarlar altında 160x büyütmede görüntüleyin.

Görüntüleri analiz etmek için ImageJ'deki ObjectJ eklentisini kullanın.