Bakteriyel Enfeksiyona Bağlı Amiloidlerin Tiyoflavin T Floresansı Kullanılarak Ölçülmesi

Fosfat tamponlu salin içinde çözülmüş, amiloide özgü bir floresan boya olan tiyoflavin T'nin çalışan bir çözeltisini içeren bir küvet alın.

Küveti bir spektroflorometreye yerleştirin ve temel floresan sinyalini kaydedin.

Taramayı duraklatın ve küveti çıkarın.

Virülan Pseudomonas bakterileri ile enfekte olmuş pulmoner endotel hücrelerinden toplanan filtre ile sterilize edilmiş kültür süpernatanını ekleyin.

Süpernatan, yanlış katlanmış, beta tabakası açısından zengin proteinler olan amiloid agregatları içerir.

Eşit dağılım sağlamak için içeriği ters çevirerek yavaşça karıştırın.

Küveti spektroflorometreye yeniden yükleyin ve zamana dayalı bir floresan sinyali elde etmek için taramaya devam edin.

Tiyoflavin T, spesifik olarak beta tabakası açısından zengin amiloidlere bağlanır ve bu da floresansın artmasına neden olur.

Aynı ayarları kullanarak bir floresan taraması gerçekleştirin.

Başlangıca göre floresandaki bir artış, kültür süpernatanında enfeksiyona bağlı amiloidlerin varlığını ve nispi bolluğunu gösterir.

Süpernatan içindeki amiloidleri ölçmek için, bir mililitrelik spektrofotometre küvetinde bir mililitre PBS'ye 20 mikrolitre taze hazırlanmış ve filtrelenmiş 50X tioflavin T stok çözeltisi ekleyin ve seyreltilmiş numuneyi bir spektroflorometreye yükleyin.

425 nanometrelik bir uyarım kullanarak temel floresan emisyonunu ölçün. Floresan emisyonunun iki nanometrelik artışlarla 450 ila 575 nanometre arasında taranması. Ardından cihazı, 60 saniye boyunca her 0,2 saniyede bir veri toplama ile 425 nanometre uyarma ve 482 nanometre emisyon kullanarak hızlandırılmış tarama gerçekleştirecek şekilde ayarlayın.

Taramayı 20 saniye sonra duraklatın ve küvete 10 mikrolitre filtre ile sterilize edilmiş süpernatant ekleyin. Ters çevirerek karıştırdıktan sonra, küveti spektroflorometreye yeniden yükleyin ve son 40 saniye boyunca zamana dayalı taramaya devam edin. Hızlandırılmış çekim tamamlandıktan sonra, orijinal tarama ayarlarını kullanarak son bir floresan emisyon spektrumu taraması gerçekleştirin.