JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Microbiology
0 görüntülenme • 2:28 dk. • September 26th, 2025
Kan dolaşımı enfeksiyonu olan yenidoğanlardan izole edilen bir E. coli kültürü ile başlayın.
Bakterileri peletlemek için santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti antibiyotik içermeyen bir ortamda yeniden süspanse edin.
Bağırsak epitel hücresi tek tabakası içeren transwell ekli bir plaka alın.
Tek katmanlı bütünlüğü doğrulamak için hücre katmanındaki elektrik direncini bir probla ölçün.
Bakteri süspansiyonunu ek parçaya ekleyin ve inkübe edin.
Bakteriler epitel hücrelerine yapışır, veziküller içinde içselleştirilir ve transsitoz adı verilen bir işlemle hücreler boyunca alt kuyuya taşınır.
Elektrik direncini tekrar ölçün; Kararlı bir değer, transsitoz sırasında sağlam bir tek tabakayı doğrular.
Ek parçayı yeni bir kuyuya aktarın ve ortamı önceki alt kuyudan toplayın.
Toplanan ortamı bir agar plakasına yerleştirin ve bakteri kolonilerini geliştirmek için inkübe edin.
Bağırsak epitel bariyeri boyunca E. coli transsitozunun derecesini belirlemek için kolonileri sayın.
Aşılamayı takiben her 30 dakikada bir, yeni kuyucukları antibiyotiksiz 500 mikrolitre TCM ile doldurun ve ekleri bu yeni kuyucuklara aktarın. Her bir ek parça için kullanılmış toplama kuyusundan medyayı ayrı bir etiketli tüpe toplayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Transwell plakasını zaman noktaları arasında inkübatöre geri koyun.
Her ekleme için, farklı zaman noktalarından toplanan medyayı birleştirin ve kısaca girdap yapın. Deneyin ilk iki saatinde transsitoz olan bakteri sayısını ölçmek için parça seyreltme yöntemini kullanarak toplanan ortamı LB burgu plakalarına yerleştirin. Medyayı dört ve altı saatte toplayın.
Ek olarak, altı saat sonra medyayı kontrol kuyularından kaplayın. Altı saatte TEER'i ölçün ve kaydedin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, iz seyreltme LB plakalarında bakteri kolonilerini manuel olarak sayın.