JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Microbiology
0 görüntülenme • 3:13 dk. • September 26th, 2025
Antibiyotik kloramfenikol'e duyarlı bir S. aureus kültürü alın.
Bakterileri peletlemek ve süpernatanı çıkarmak için santrifüjleyin.
Peleti besin sınırlayıcı ortam içeren bir tüpe aktarın ve inkübe edin. Besin stresi, bakterinin yabancı DNA'yı içselleştirme yeteneği olan yetkinliği artırır.
Tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peleti taze besin sınırlayıcı ortamda yeniden süspanse edin.
Ardından, kloramfenikol'e dirençli bir gen taşıyan bir S. aureus suşundan ekstrakte edilen DNA'yı ekleyin. Kuluçkaya yatırın.
DNA alım mekanizması, DNA'yı tek bir iplik halinde işler ve onu bakteri kromozomuna entegre olduğu sitoplazmaya taşır.
Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın. Peleti besin açısından zengin ortamda yeniden süspanse edin.
Süspansiyonu kloramfenikol içeren erimiş, besin açısından zengin agara aktarın.
Karışımı bir tabağa dökün ve inkübe edin.
Kloramfenikol'e dirençli kolonilerin büyümesi, başarılı DNA alımını gösterir.
Alıcı hücreyi gece boyunca, beş mililitre TSB'de 37 santigrat derecede çalkalayarak kültürleyin. Ertesi sabah, 0,5 mililitre gece kültürünü 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Hücreleri santrifüjleme ile çökeltin. Daha sonra hücreleri 10 mililitrelik bir tüpte 2 mililitre CS50 ortamıyla askıya alın. Daha sonra bakterileri 37 santigrat derecede, geç üstel faza kadar sekiz saat boyunca dakikada 180 dönüşte sallayarak büyütün.
Hücreleri santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı atın ve hücreleri 10 mililitre taze CS2 ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna 10 mikrogram saflaştırılmış plazmit veya genomik DNA ekleyin.
Kültürü dakikada 180 devirde sallayın. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri 10 mililitre BHI ortamında yeniden süspanse edin.
Hücre süspansiyonunu 90 mililitre eritilmiş BHI agar takviyesi ile karıştırın Litre başına 32 miligram kloramfenikol ve litre başına beş mikrogram tetrasiklin kontrol deneyinde. Karışımı 90 milimetrelik petri kaplarına dökün ve hızla soğutun ve agarın katılaşmasına izin verin. Direnç özelliklerini doğrulamak için kürdan kullanarak kolonileri uygun antibiyotik içeren plakalara çoğaltın.