Negatif İyon Değişim Kromatografisi ile Bir Bakteriyel Proteinin Seçici Saflaştırılması

Seçici protein bağlanması için pozitif yüklü fonksiyonel gruplar içeren bir iyon değiştirici reçine çözeltisi ile başlayın.

Daha sonra, patojenik bakteri Helicobacter pylori'den bir virülans faktörünü aşırı eksprese etmek üzere tasarlanmış konakçı bakteri hücrelerinden elde edilen bir protein özütü alın.

Ekstrakt, pH 8'de bir tamponda konakçı hücre proteinleri ile birlikte hedef virülans faktörünü içerir.

Protein ekstraktını reçine ile karıştırın ve homojen protein-reçine etkileşimini sağlamak için çalkalayarak inkübe edin.

Tampon pH'ından daha düşük izoelektrik noktalara sahip olan konakçı proteinler, negatif yüklü hale gelir ve pozitif yüklü reçineye bağlanır.

Tampon pH'ına yakın bir izoelektrik noktaya sahip olan hedef protein, büyük ölçüde yüksüz kalır ve bağlanmadan kalır.

Protein-reçine bulamacını bir kromatografi kolonuna aktarın ve reçinenin çökmesine izin verin.

Bağlanmamış hedef proteini içeren sıvı fazı toplayın.

Hedef proteinin maksimum geri kazanımını sağlamak için reçineyi tamponla durulayın.

15 mililitre DEAE reçinesi hazırlamak için, 0,6 gram DEAE reçinesi kuru tozunu oda sıcaklığında oda sıcaklığında 30 mililitre Tris-HCl tamponu içinde en az bir gün süspanse edin.

Reçineyi bir dakika boyunca dört santigrat derecede 10.000 kez g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın. Ardından 15 mililitre Tris-HCl tamponu ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, yeniden süspansiyon adımları dört kez daha, 15 mililitre çökelmiş reçineyi daha sonra kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın.

Dört santigrat derecede çalışarak, hazırlanan çözünür proteinlerden 45 mililitreyi 15 mililitre reçineye ekleyin ve karıştırma çubuklu 100 mililitrelik bir behere aktarın. Protein reçinesi bulamacını bir saat boyunca dört santigrat derecede bir karıştırma plakası kullanarak karıştırın. Daha sonra, protein reçinesi bulamacını, muslukla donatılmış plastik veya cam bir sütuna dökün ve reçinenin yerçekimi altında çökmesine izin verin.

Kolondaki sıvı seviyesi reçinenin hemen üzerine gelene kadar protein çözeltisinin yerçekimi akışıyla kolondan geçmesine izin vermek için musluğu açın. Akışı, saflaştırılmış nötrofil aktive edici proteini içeren bağlanmamış fraksiyon olarak toplayın. Kolona 15 mililitre buz gibi Tris-HCl tamponu ekleyin.

Yıkama tamponunun, kolondaki sıvı seviyesi reçinenin hemen üzerine gelene kadar yerçekimi akışıyla kolondan geçmesine izin vermek için vanayı tekrar açın. Akışı yıkama fraksiyonu olarak toplayın. Ek yıkama fraksiyonlarını toplamak için buz gibi soğuk tamponla yıkamayı dört kez daha tekrarlayın.