Bakteriyel Aşı Antijeninin Yapısal Bütünlüğünü Değerlendirmek için Western Blot

Membran protein-nanolipoprotein parçacıklarından protein bantları içeren bir SDS-PAGE jeli alın. Bu kompleksler, Chlamydia enfeksiyonuna karşı umut verici bir aşı antijeni olan Chlamydia oligomerik membran proteinini veya MP'yi taşır.

Kontrol olarak saflaştırılmış oligomerik MP'den protein bantları kullanın.

Jeli, western blot membranını ve kurutma bileşenlerini kuru bir kurutma sisteminde birleştirin.

Çözünen proteinleri zara aktarmak için bir elektrik akımı uygulayın.

Membranı çıkarın ve deterjanlar ve birincil antikorlar içeren bir tamponda inkübe edin.

Deterjanlar spesifik olmayan etkileşim bölgelerini bloke ederken, birincil antikorlar MP'yi hedef alır.

Bağlanmamış birincil antikorları çıkarmak için membranı yıkayın.

Birincil antikorları hedef alan florofor konjuge ikincil antikorlarla inkübe edin.

Fazla ikincil antikorları çıkarmak için zarı yıkayın.

Membranın floresan görüntülerini yakalayın.

Kontrol oligomerik MP'si ile eşleşen moleküler bantlar, MP'nin kompleksler içindeki yapısal bütünlüğünü doğrulayarak antijenik potansiyelini destekler.

Numuneleri SDS-PAGE ile çözün ve Western blot analizi için ticari bir kuru lekeleme sistemi kullanarak jel yığınlarını aktarın. Lekeleri yığından çıkarın ve mililitre MAb40 başına %0.2 TWEEN 20 ve 0.5 mikrogram veya delta-49ApoA1 proteininden HIS etiketine karşı yönlendirilmiş mililitre başına 0.2 mikrogram MAbHIS antiHIS etiketi antikoru içeren bir bloke edici tamponda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Her lekeyi PBST ile yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Lekeleri, 1 ila 10.000'lik bir seyreltmede bir florofora konjuge edilmiş ikincil antikor içeren bir bloke edici tamponda bir saat inkübe edin. Yıkamaları PBST ile tekrarlayın ve son yıkamadan sonra bir floresan görüntüleyici kullanarak görüntüyü yakalayın.