JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Microbiology
0 görüntülenme • 4:11 dk. • November 28th, 2025
Endospor oluşturan bir bakterinin vejetatif hücreleri ve endosporları ile diğer bakterileri içeren çevresel bir örnek alın.
Endosporlar, olumsuz koşullarda hayatta kalmalarına yardımcı olan koruyucu bir örtüye sahiptir.
Vakum filtrasyon ünitesi kullanarak, numuneyi filtreleyerek hücreleri ve endosporları bir zar üzerinde hapseye düşürür.
Zarı bir kaba koyup küçük parçalara kesin.
Parçaları bir tüpe aktarın, bir tampon ekleyin ve tüpü karıştırarak hücreleri ve endosporları serbest bırakın.
Vejetatif hücre yapılarını zayıflatmak için endosporlara zarar vermeden yüksek sıcaklıkta kışkırtma ile kuluçka yapın.
Numuneyi soğutun, sonra lizozim ekleyin ve çaltımarak kuluçka yapın. Lizozim, vejetatif hücrelerin hücre duvarını bozarak onların yırtılmasına neden olur.
Sodyum hidroksit ve bir deterjan ekleyin ve hücresel makromolekülleri ve kalıntıları bozunarak dayanıklı endosporları koruyarak kuluçka yapın.
Endosporları izole etmek için örneği filtreleyin. Endosporları yıkayıp fazla reaktifleri çıkararak daha ileri analiz için hazırlayın.
Filtreleme ünitesi ve vakum pompası metin protokolüne uygun şekilde hazırlandıktan sonra, etanol alevli sterilize edilmiş forseps kullanarak steril nitroselüloz membranı filtrasyon ünitesine eklenin. Az önce hazırlanmış süpernatant örneğinin yarısını membran filtrasyon ünitesine ekleyin ve vakum pompasını kullanarak membrandaki hücreleri toplayın. Sıvı filtreden tamamen geçtiğinde, vakum pompasını durdurun.
Sterilize edilmiş forseps kullanarak zarı dikkatlice çıkarıp steril bir petri kabına yerleştirin. Temiz bir steril membran parçası ile, filtreleme kalan çözeltinin yarısınla tekrarlanın. Toplanan biyokütlesteki vejetatif hücrelerden endosporları ayırmak için, donmuşsa zarı eritin ve etanol alevli sterilize makasla daha küçük parçalara kesin.
Zar parçalarını steril iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve 900 mikrolitre 1X TE tampon ekleyin. Biyokütleyi zardan salınmak için vortex ile iyice karıştırın. Tüpü 65 derece Celsius ve 80 RPM'de 10 dakika boyunca kuluçka yapın.
Sonra tüpü kuluçka makinesinden çıkarın ve 15 dakika soğumasına izin verin. Taze hazırlanmış lizozimi 100 mikrolitre ile mililitrede iki miligram konsantrasyona ekleyin ve örneği 37 derece Celsius ve 80 RPM'de 60 dakika kuluçka geçirerek vejetatif hücreleri lizize edin. Liz tamamlandıktan sonra, numuneye 250 mikrolitre 3 normal sodyum hidroksit ve 250 mikrolitre %6 SDS çözeltisi eklenin. Oda sıcaklığında ve 80 RPM'de 60 dakika kuluçka yapın.
Sonra, 25 milimetre çapında membranları tutan steril bir filtrasyon ünitesi için otoklavlama ile hazırlanır. Filtreleme ünitesi soğuduktan sonra, üzerine 25 milimetre çapında 0,2 mikrometrelik nitroselüloz membranı yerleştirilin.
Örneği membrana ekleyin ve vakum pompasını kullanarak sıvıyı filtreleyin, böylece endosporları membran üzerinde yakalarken, vejetatif hücre materyali geçerken içinden geçer.