Hücre içi bakteri toplulukları içeren fare mesane epitel hücrelerinin izolyasyonu

Fare mesanesinden çıkarılan mesane epitel hücreleriyle başlayın; fare mesanesinde floresan işaretli üropatonik E. coli enfekte edilmiştir.

Enfeksiyon sırasında bu bakteriler epitel hücrelerine girer ve konak bağışıklık sisteminden koruyan biyofilm benzeri yapılar olan hücre içi bakteri toplulukları (IBC) oluşturur.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, IBC'leri bireysel epitel hücreleri içinde hapsedilen büyük floresan agregalar olarak tanımlayın.

Tek IBC içeren epitel hücrelerini izole etmek için çekilmiş cam bir kapiler kullanarak bir ağız mikropipetleme sistemi oluşturun.

Kapiller ucu kısaca PBS'ye batırarak kapiller kaynaklı sıvı alımını azaltın.

Kapilleri seçilen floresan epitel hücresine yakın konumlandırın ve nazik emme uygulayarak enfekte olmayan hücreler ve ekstrahücre bakterilerden kaçınarak tek bir IBC içeren hücre çekilin.

Hücreyi hafif pozitif basınçla steril bir mikrosantrifüj tüpüne atarak bakteriyel canlılığı koruyun.

Bu yöntem, IBC'leri barındıran epitel hücrelerinin tek hücreli analiz için izole edilmesini sağlar.

Tüm hücreler kazıdıktan sonra, çekilmemiş bir cam kapiler ucunu aspiratör tüpünün kauçuk tıkacına yerleştirin ve 1 mililitrelik pipet ucunun dar ucunu borunun diğer açık ucuna sıkıca yerleştirin.

2 mililitrelik aspirasyon pipetinin dar ucunu 1 mililitrelik pipet ucunun açık, daha geniş ucuna sıkıca oturtun ve kazımış hücre süspansiyonunu diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. 20 ila 40X büyütme kullanarak, IBC'leri büyük floresan agregalar olarak tanımlayın ve cam kapillerin ince ucunu 1 saniyeliğine yeni bir PBS tüpüne batırarak istenmeyen hacmin kapıl etkisiyle alınmasını azaltın.

İlgilendiğiniz bir IBC bulunduğunda, kapiller tüpün açık ucunu yavaşça IBC'ye doğru getirin ve aspirasyon pipetine çok küçük bir emici kuvvet uygulayarak IBC'yi cam kapiler içine yönlendirin. Sonra, kapilleri boş 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne taşıyın ve hafif bir pozitif basınç uygulayarak damlayı ve IBC'yi tüpün içine atabilirsiniz.