JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biological Techniques
0 görüntülenme • 3:43 dk. • July 8th, 2025
Ortamda floresan protein kodlayan plazmit DNA veya pDNA süspansiyonu ile başlayın. pDNA süspansiyonuna biyouyumlu, katyonik polimer kaplı manyetik nanopartiküller ekleyin ve inkübe edin.
Pozitif yüklü katyonik polimerler, negatif yüklü pDNA ile elektrostatik olarak etkileşime girer ve konjuge olur, bu da pDNA yoğunlaşmasına ve genel olarak pozitif yüklü 'manyetik poliplekslerin' oluşumuna neden olur.
Şimdi, polipleks karışımı, yapışık birincil fare nöronal hücre kültürü içeren çok kuyucuklu bir plakaya aktarın. Çok kuyulu plakayı manyetik bir plakanın üzerine monte edin ve inkübe edin.
Manyetik plaka tarafından üretilen manyetik alan, poliplekslerin nöronal hücre yüzeyi üzerinde tortulaşmasına ve birikmesine neden olur. Hücre yüzeyi ile bu yakın temas, pozitif yüklü poliplekslerin negatif yüklü hücre zarı ile ilişkili proteoglikanlara spesifik olmayan bağlanmasını kolaylaştırır.
Daha sonra, polipleksler endositoz yoluyla içselleştirilir - hücre zarının yerel bölgelerinin istila edildiği ve endozom adı verilen zara bağlı veziküller oluşturmak için sıkıştığı bir süreç.
Sitoplazmanın içinde, poliplex'in katyonik polimerleri endozomda proton birikimine neden olur. Yük nötrlüğünü korumak için eşzamanlı klorür iyonu akışı, endozomal iyonik kuvveti artırarak su akışına yol açar.
Sonunda, endozomlar ozmotik basınç nedeniyle şişer ve yırtılır ve polipleksleri sitoplazmaya bırakır. Polipleksler içindeki yoğunlaştırılmış pDNA, artan sitozolik motiliteyi kolaylaştırırken, katyonik polimerler pDNA'yı sitoplazmik nükleaz bozunmasından korur.
Poliplekslerin ayrışmasını takiben, serbest kalan pDNA - nükleer zarın geçici olarak parçalandığı uygun hücre döngüsü fazı sırasında - çekirdeğe yer değiştirir. pDNA ile başarılı bir şekilde transfekte edilen hücreler, floresan proteinleri eksprese eder.
Motor nöronları kültürlemek için, bunları 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 500 mikrolitre kültür ortamında 5.000 ila 10.000 hücreye seyreltin. Ardından, laminat çözeltisini bir P1000 pipet ucuyla çıkarın. Kurumayı önlemek için kültür ortamında seyreltilmiş motor nöronları hemen kaplama plakalarına aktarın.
DNA'yı hazırlamak için, 1 mikrogram DNA'yı 50 mikrolitre nöronal kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 5 saniye boyunca girdap yapın. Boncuk tüpünü hazırlamak için, 50 mikrolitre nöronal kültür ortamında 1,5 mikrolitre boncuğu yeniden süspanse edin. 50 mikrolitre DNA çözeltisine 50 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Bu inkübasyon sırasında, transfekte edilecek kuyudan 100 mikrolitre kültür ortamı çekin. Daha sonra, her bir oyuklu kuyucuğa 100 mikrolitre DNA boncuk karışımı aktarın ve 24 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede manyetik plaka üzerinde 20 ila 30 dakika inkübe edin.