JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biological Techniques
0 görüntülenme • 3:31 dk. • July 8th, 2025
N-asetilnöraminik asit ve N-glikolilnöraminik asit gibi sialik asitler, memeli hücre yüzeyindeki oligosakkarit zincirlerinin distal uçlarında bulunan negatif yüklü karbonhidrat kısımlarıdır.
Ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya RP-HPLC kullanarak fare karaciğer dokusundaki bu sialik asitlerin nispi miktarlarını ölçmek için, önce izole edilmiş sialik asit karışımını türevlendirme maddesi ile muamele edin. Türevlendirme ajanı, sialik asitlerin fonksiyonel grupları ile etkileşime girerek kararlı, floresan sialik asit türevleri üretir.
Bir floresan dedektörüne bağlı bir RP-HPLC sütunu monte edin. Kolon, kromatografik çalışma sırasında sialik asit türevleri ile seçici etkileşimleri kolaylaştırmak için polar olmayan, hidrofobik, alkil zincir ligandlarına bağlanmış gözenekli silika bazlı sabit faz içerir.
Optimum kolon koşullandırma için daha az polar organik çözücü olan düşük konsantrasyonlarda asetonitril içeren sulu polar mobil faz kullanarak kolonu dengeleyin.
Türetilmiş sialik asit karışımını kolona yükleyin.
Hidrofobik bir N-asetil grubu içeren N-asetilnöraminik asit, sabit fazın hidrofobik ligandlarına, hidrofilik bir N-glikolil grubuna sahip N-glikolilnöraminik asitten daha güçlü bir şekilde adsorbe olur.
Çevrimiçi bir floresan dedektörüne bağlı standart bir HPLC sistemi kullanarak numuneleri analiz edin. Analiz için 250 milimetre uzunluğunda ve 4,6 milimetre çapında ters fazlı bir C-18 sütunu kullanın.
Çözücü A ve çözücü B'yi hazırladıktan ve metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi HPLC çalışmasını ayarladıktan sonra, 50 mikrolitre numuneyi HPLC sistemine enjekte edin.
373 nanometrelik floresan dedektörü uyarma dalga boyunu ve 448 nanometrelik bir emisyon dalga boyunu kullanarak eluentleri izleyin.
Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi Neu5Gc'nin nispi miktarını hesaplayın.