JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Immunology
0 görüntülenme • 3:06 dk. • July 8th, 2025
Primer makrofaj kültürü içeren bir plaka ile başlayın.
Makrofajlar üzerindeki toll benzeri reseptörlere bağlanan ve protein NLR ailesi pyrin alanı içeren 3 veya NLRP3'ün yukarı regülasyonunu tetikleyen bakteriyel lipopolisakkarit, LPS'yi tanıtın.
Potasyum iyonlarının dışarı akışına aracılık eden bir iyonofor ekleyin. Azalmış sitozolik potasyum NLRP3'ü aktive eder. Aktive edilmiş NLRP3, oligomerleşir ve bir adaptör proteinin alımını indükler, bu da pro-kaspaz-1'i işe alarak bir inflamatuar oluşturur.
Oto-proteoliz, pro-kaspaz-1'i, inflamatuar hücre ölümüne veya piroptoza aracılık eden aktif kaspaz-1'e dönüştürür. Piroptoz sırasında DNA hasarı nükleer yoğunlaşmaya yol açar.
Hücreleri sabitleyin ve geçirgen hale getirmek için bir deterjanla işlemden geçirin.
İnflamatuar ile ilişkili adaptör proteinine bağlanan bir birincil antikor ve birincil antikora bağlanan ve iltihabı etiketleyen floresan etiketli bir ikincil antikor ekleyin.
Çekirdeği etiketlemek için bir floresan nükleik asit boyası ekleyin. Bir floresan mikroskobu altında, hücreler yoğunlaştırılmış çekirdekleri gösterir - piroptozu gösterir - ve adaptör proteinlerin odaklarını gösterir - iltihap oluşumunu gösterir.
Nigerisin ile muamele edilen hücrelerin immünoflorokimyasal analizi için, prob etiketli hücreleri yıkayın ve hücreleri, ışıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika boyunca oyuk başına 250 mikrolitre fiksasyon ve geçirgenlik çözeltisi içinde inkübe edin.
Makrofajları taze yıkama tamponu ile üç kez daha yıkayın ve hücreleri, buz üzerinde bir saat boyunca oyuk başına bir C-terminal kaspaz alım alanı veya ASC içeren apoptozla ilişkili leke benzeri proteine karşı 250 mikrolitre birincil antikor ile etiketleyin.
İnkübasyonun sonunda hücreleri yıkayın ve numuneleri 250 mikrolitre uygun floresan boya konjuge ikincil antikor ile buz üzerinde bir saat daha etiketleyin ve son 5 dakika boyunca 4 mikrolitre uygun bir floresan nükleer boyama boyası ekleyin.
Hücreleri soğuk yıkama tamponunda 3 kez yıkadıktan sonra, lameller gösterildiği gibi 7 mikrolitre solma önleyici montaj ortamı ile slaytlara monte edin ve makrofajları floresan konfokal mikroskopi ile görüntüleyin.