JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Neuroscience
0 görüntülenme • 3:33 dk. • July 8th, 2025
Bir nörosfer kültürü, serbest yüzen nöroepitelyal progenitör hücre kümeleri ile başlayın.
Bu nöroküreleri bir gömme tabakasına aktarın.
Medyayı çıkarın. Her nörosfere proteinler ve büyüme faktörleri içeren bir damla hücre dışı zar matrisi ekleyin.
Matrisin katılaşması için kuluçkaya yatırın, nörosferleri içine gömün.
Şimdi, nörosfer ortamını kullanarak matrise gömülü nörosferleri, nörosfer ortamı içeren bir kültür plakasına aktarın.
Kuluçkaya yatmak. Hücre dışı membran matriksi ve bileşenleri, nöroepitelyal progenitör hücrelerin çoğalan ve sıvı dolu lümenler oluşturan nöroepitelyal hücrelere farklılaşmasını kolaylaştırır.
Kuluçka sonrası, nörosferleri önceden ısıtılmış beyin organoid ortamı içeren bir eğirme şişesine aktarın. Hücresel büyümeyi teşvik ederek gelişmiş oksijen ve besin difüzyonu için karıştırarak inkübe edin.
Ortamdaki büyüme faktörleri ve küçük molekül inhibitörleri, nöral farklılaşmayı teşvik eder ve olgun beyin organoidleri oluşturarak belirli beyin bölgelerinin hücrelerine dönüşür.
Bu işleme başlamak için, daha önce steril makasla kesilmiş 2 milimetrelik bir uç kullanarak nörosferleri 200 mikrolitrelik bir mikropipetle toplayın. Daha sonra, nörosferleri birbirinden yaklaşık 5 milimetre uzağa, 100 milimetrelik bir tabakta bir parafin film üzerine yerleştirin ve kalan ortamın mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın. Ardından, her bir nörosfere bir damla EHS matrisi ekleyin.
EHS matris damlalarını nörosferlerle 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Bundan sonra, nörosferleri nörosfer ortamıyla yıkayarak parafin filminden dikkatlice yıkayın. Daha sonra, nörosferleri önümüzdeki dört gün boyunca inkübe edin ve ikinci günde 2 mililitre taze nörosfer ortamı ekleyin.
Bu prosedürde, her bir eğirme şişesine yan kollarından 100 mililitre beyin organoid ortamı ekleyin ve ortamı inkübatörde en az 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede önceden ısıtın. Ardından nörosferlerin hepsinin ayrıldığından emin olun. İki veya daha fazlası EHS matrisi ile bağlanırsa, bağlantı matrisini bir neşter ile keserek ayırın.
25 RPM'de bir karıştırma programı ayarlayın. EHS matrisine gömülü nöroküreleri, 100 mililitre organoid ortam içeren eğirme şişelerine dikkatlice aktarın. Bunu takiben, eğirme şişelerini 37 santigrat derecede 14 gün boyunca inkübatörde manyetik bir karıştırma platformuna yerleştirin. Bu, organoid kültürün sıfırıncı günüdür. Ortamın yarısını çıkararak ve aynı miktarda taze ortam ekleyerek ortamı haftada bir kez değiştirin.