JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Neuroscience
0 görüntülenme • 3:30 dk. • July 8th, 2025
Yapay beyin omurilik sıvısında veya aCSF'de sağlam bir fare gözü alın ve retinayı içeren vizör lastiğini izole etmek için kesin.
Nöronal hücreleri açığa çıkaran iç sınırlayıcı zarı çıkarmak için enzimatik bir çözelti ile muamele edin.
Sindirimi durdurmak için dokuyu bir inhibisyon solüsyonuna batırın ve fazla solüsyonu çıkarmak için yıkayın.
Dokuyu koruyarak hücresel metabolizmayı yavaşlatmak için dokuyu düşük sıcaklıkta özel bir inkübatöre yerleştirin.
Bu inkübatör, dokuları monte etmek için bir ağa sahip bir ana odadan oluşur. Hazne aCSF ile doldurulur ve doku işlevselliğini korumak için sıcaklığı ve pH'ı kontrol edilir.
Mikrobiyal kontaminasyonu ortadan kaldırmak için, aCSF başka bir odaya pompalanır ve herhangi bir mikrobu öldürmek için ultraviyole radyasyon ile muamele edilir.
Sterilize edilmiş aCSF daha sonra ana hazneye geri pompalanır.
Retinayı izole etmek için vizör lastiğini çıkarın, retinayı çevreleyen dokudan ayırın ve inkübatöre geri koyun.
Retinal tüm montaj hazırlığı için, ötenazi yapılmış bir hayvanın gözlerini hemen enüklee edin. Ora serrata boyunca küçük bir kesik yapın ve gözleri oda sıcaklığında karbojen kaynağı olan Ames Media veya aCSF'ye yerleştirin. Bundan sonra, ora serrata boyunca küçük bir makasla keserek kornea, lens ve vitreusu hemen çıkarın ve forseps ile çıkarın. Dokuyu oda sıcaklığında inkübasyon sistemine yerleştirin.
İç sınırlayıcı zarı çıkarmak için, retinayı içeren göz kabını papain, L-sistein, EDTA ve DNAse içeren küçük bir cam kavanoza 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca aktarın. Çözeltiye kapaktan karbojen uygulayın, ancak kabarcık yapmayın. Earl'ün BSS'sinde dokuyu 10 dakika boyunca bir ovomukoid ve BSA çözeltisine yerleştirerek enzimatik sindirimi durdurun. Ardından, dokuyu aCSF ile iyice yıkayın.
Daha sonra, dokuyu inkübasyon sistemine aktarın ve sıcaklığı yaklaşık 15 ila 16 santigrat dereceye düşürün. Bunu takiben, retina dokusunu mikroskoba aktarın; Retinayı göz kabından izole edin ve bir jiletle dört parçaya bölün. Retinanın tamamı gerekliyse, düz durmasını sağlamak için retinanın çevresinde dört küçük kesi yapın.
Bu doku artık elektrofizyoloji için mikroskoba aktarılabilir veya Beyin Kuvatöründe muhafaza edilebilir. Doku, pH ve sıcaklık ölçümleri için probları içeren ana haznede tutulur. İkinci bir oda, ana odadan izole edilir ve çözelti içinde yüzen bakterileri ışınlamak için 1.1 watt UVC ışığına maruz bırakılır. aCSF'yi iki hazne boyunca dolaştırmak için peristaltik bir pompa ve ana hazneyi soğutmak veya ısıtmak için bir Peltier termoelektrik soğuk plaka kullanın.