Asılı Damla Yöntemi ile Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitörlerin Üretilmesi

Bir fare embriyonik kök hücre süspansiyonunu ele alalım.

Santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri bir nöral farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.

Süspansiyon damlacıklarını bir kültür plakası kapağının iç tarafına yerleştirin.

Damlacıkların kurumasını önlemek için alt plakaya bir tampon ekleyin. Kapağı alt plakaya yerleştirin, asılı bir damla kültürü oluşturun ve inkübe edin.

Yerçekimi nedeniyle, hücreler kümelenir ve embriyoid cisimler veya EB'ler olarak adlandırılan üç boyutlu kümeler oluşturur.

Damlacıkları farklılaşma ortamını içeren bir plakaya yerleştirin ve EB'lerin büyümesi için çalkalama altında inkübe edin.

Ortamı santrifüjleyin ve çıkarın; retinoik asit ile desteklenmiş farklılaşma ortamındaki EB'leri yeniden süspanse edin, bunları bir kültür plakasına aktarın ve inkübe edin.

Retinoik asit hücrelere girer ve bir transkripsiyon kompleksinin oluşumunu tetikler. Kompleks, nöral progenitör hücrelere farklılaşmayı tetikleyerek gen ekspresyonunu indükler.

Farklılaştırılmış EB'ler, aşağı akış uygulamaları için hazırdır.

Asılı damla hücre kültürünü kurarak başlayın. 10 santimetrelik bir hücre kültürü plakası için, konsantrasyonu 20 mikrolitre farklılaşma ortamı başına 500 hücreye ayarlayın. 50 adet 20 mikrolitrelik damlacık için yeterli hücre süspansiyonu hazırlayın. 20 mikrolitrelik hücre süspansiyonu damlacıklarını bir doku kültürü plakasının kapağına yerleştirmek için bir mikropipet veya tekrarlayıcı pipet kullanın ve damlacıkların birleşmelerini önlemek için birbirine çok yakın olmadığından emin olun.

Plakayı 5 ila 10 mililitre PBS ile doldurun ve kapağı dikkatlice plakaya geri koyun. Kültürü 37 santigrat derece inkübatörde inkübe edin. İki gün sonra, damlacıkları kapaktan toplayın ve bunları 10 mililitre farklılaşma ortamı ile doldurulmuş 10 santimetrelik bir hücre kültürü süspansiyon plakasına yerleştirin. Ardından, plakayı inkübatörde düşük hıza ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin. İki gün sonra, hücreleri üç dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.

Embriyoid cisim farklılaşmasını nöral progenitör hücrelere indüklemek için, hücreleri 5 mikromolar retinoik asit ile farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Plakayı iki gün boyunca inkübe edin. Ardından, plakayı eğerek ve pipetleyerek ortamın en az yarısını taze ortamla değiştirin.