JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Neuroscience
0 görüntülenme • 3:03 dk. • July 8th, 2025
İki çok kuyulu plaka ile başlayın: biri bir polimer ile kaplanmış kazınmış bir tabana ve diğeri polimer kaplı bir lamel içerir.
Embriyonik nöronların yüksek yoğunluklu bir süspansiyonunu, kazınmış alt kısımla birlikte plakaya tohumlayın. Kuyu içeren lamel için ultra düşük yoğunluklu bir nöron süspansiyonu ekleyin.
Polimerlere nöronal bağlanmaya izin vermek için inkübe edin.
Lameli çıkarın ve yüksek yoğunluklu nöron kültürünün üzerine yerleştirin, böylece nöronların birbirine bakmasını sağlayın.
Yükseltilmiş yapılara sahip kazınmış yüzey, farklı yoğunluklardaki nöronları ayıran bir mikro boşluk oluşturur.
Yüksek yoğunluklu kültür, bir besleyici katman görevi görür ve nöral büyüme faktörünü salgılar.
Kapalı difüzyon alanı nedeniyle, büyüme faktörleri nöronların etrafında birikerek büyümelerini ve nöronal projeksiyonların gelişmesini kolaylaştırır.
Nöronal olmayan hücrelerin büyümesini seçici olarak inhibe eden sitozin arabinozit içeren bir nörobazal ortam tanıtın.
Nöronal kültürü korumak için düzenli olarak taze bir nörobazal ortamla doldurun.
Bu prosedürde, kültür başlığına yüksek yoğunluklu nöronlar için kazınmış tabanlara sahip 24 oyuklu plakalar yerleştirin. Önceden koşullandırılmış ortamın 300 mikrolitresini vakumla çıkarın. Daha sonra, mililitre başına 250.000 nöronda 0.6 mililitre yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonu plakası.
Diğer 224 oyuklu plakaları lamellerle birlikte kültür davlumbazına yerleştirin. Lameller üzerine mililitre başına 10.000 nöronda 0.6 mililitre düşük yoğunluklu hücre süspansiyonu kaplamadan önce, önceden koşullandırılmış ortamın 300 mikrolitresini vakumla çıkarın. Daha sonra, 24 oyuklu plakaların tümünü inkübatöre geri koyun ve iki saat inkübe edin. Bundan sonra, düşük yoğunluklu lamellerin yüksek yoğunluklu kültüre yapışan nöronlarla çevrilmesi ve nöronların birbirine baktığından emin olun. Daha sonra, iki plakayı kokültür ile inkübatöre geri koyun.
DIV 5'te 300 mikrolitre taze besleme ortamı ekleyerek ko-kültürleri besleyin. Bu ilk beslemeyi takiben, her hafta her kuyucuğa sitozin arabinozit içermeyen 300 mikrolitre taze besleme ortamı ekleyin. Kültürün bir aydan fazla saklanması durumunda, bir aylık zaman noktasının ötesinde, ortamın yarısını her hafta taze besleme ortamıyla değiştirin.