JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Neuroscience
0 görüntülenme • 2:18 dk. • July 8th, 2025
Çok soylu farklılaşma kabiliyetine sahip yapışık insan pluripotent kök hücreleri içeren çok kuyucuklu bir plaka ile başlayın.
Dimetil sülfoksit veya DMSO içeren bir kök hücre ortamı tanıtın.
DMSO hücrelere girer ve hücre döngüsünün, hücre döngüsünün ilk aşaması olan Boşluk 1 veya G1 fazından senteze veya S fazına ilerlemesini önler.
Bu, G1 fazında tek tip bir hücre popülasyonu oluşturur ve farklılaşma yeteneklerini arttırır.
Ortamı, BMP ve TGF-β sinyal yollarının inhibitörlerini içeren, besin açısından zengin bir ektodermal farklılaşma ortamı ile değiştirin.
Bu inhibitörler, kök hücreler üzerindeki spesifik ALK reseptörlerine bağlanarak BMP ve TGF-β sinyal yollarını bloke eder ve bunların endoderm ve mezoderm öncülerine farklılaşmasını önler.
Bu, G1 ile tutuklanan kök hücrelerin, nöral farklılaşma yeteneğine sahip ektodermal öncülere seçici farklılaşmasına izin verir.
Hücrenin hayatta kalmasını sağlamak için besin ve farklılaşma faktörü seviyelerini korumak için ortamı düzenli olarak yeni bir ortamla değiştirin.
Hücreleri 2D kültürler için tarif edildiği gibi DMSO ile ön işlemden geçirin ve Noggin ve SP431542 stok çözeltileri hazırlayın. Üç ila dört günlük medya değişimi için nakavt DMEM'de yeterli% 10 nakavt serum replasmanı veya KOSR hazırlayın. Makalede anlatıldığı gibi önceden ısıtılmış KOSR nakavt DMEM'e Noggin ve SP431542 ekleyerek ektodermal farklılaşma ortamı hazırlayın.
DMSO ön işleminden sonra, hücrelerden ortamı aspire edin ve her oyuğa 2 mililitre farklılaşma ortamı ekleyin. Hücrelerin bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede üç ila dört gün boyunca inkübe etmesine izin verin ve ortamı günlük olarak taze farklılaşma faktörleriyle değiştirin.